黃金膠囊對2型糖尿病大鼠肝組織eIF2α及GRP78表達的影響

余臣祖 秦雙紅 高攀 張朝寧

摘要：目的? 觀察黃金膠囊對2型糖尿?。═2DM）大鼠肝組織eIF2α、GRP78表達的影響，探討其可能的作用機制。方法? 采用高糖高脂飼料喂養聯合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射制作T2DM大鼠模型。成模大鼠隨機分為模型組、羅格列酮組和黃金膠囊低、中、高劑量組，另取8只大鼠為正常組。各給藥組給予相應藥物灌胃，模型組和正常組給予生理鹽水灌胃，連續10周。Western blot和RT-PCR分別檢測大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白和mRNA的表達，HE染色觀察肝組織病理形態。結果? 與正常組比較，模型組大鼠eIF2α、GRP78蛋白和mRNA表達均明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠eIF2α mRNA表達明顯降低（P<0.05），羅格列酮組較黃金膠囊中、低劑量組差異有統計學意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當（P>0.05）。HE染色顯示黃金膠囊各劑量組大鼠肝臟病理損害減輕，高劑量組減輕最明顯。結論? 黃金膠囊可抑制模型大鼠肝組織eIF2α、GRP78表達的上調，減輕病理損害，從而改善肝組織內質網應激，降低血糖。

關鍵詞：黃金膠囊;糖尿病;內質網應激;大鼠

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906074

Effects of Huangjin Capsules on Expressions of eIF2α and GRP78

in Liver of Type 2 Diabetes Mellitus Rats

YU Chenzu1，2， QIN Shuanghong1， GAO Pan1， ZHANG Chaoning1

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730101， China;

2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China

Abstract： Objective To explore the effects of Huangjin Capsules on the expressions of eIF2 and GRP78 in the liver of type 2 diabetes mellitusrats （T2DM）; To explore its possible mechanism of action. Methods T2DM rat model was established by high-sugar and high-fat diet combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin. The model rats were randomly divided into model group， rosiglitazone group， Huangjin Capsules low-， medium- and high-dosage groups. Another 8 rats were chosen as normal control group. Each administration group was given relevant medicine for gavage， while model group and normal control group were given saline for gavage， for consecutive 10 weeks. Western blot and RT-PCR were used to detect theprotein and mRNA expressions of eIF2α and GRP78 in rat liver tissue. HE staining was used to observe the pathological morphology of liver tissue. Results Compared with the normal control group， the protein and mRNA expressions of EIF2 and GRP78 significantly increased in the model group （P<0.05）. Compared with model group， eIF2 mRNA expressions decreased in both rosiglitazone group and Huangjin Capsules medium- and low-dosage groups， with statistical significance （P<0.05）. The effects of Huangjin Capsules high-dosage group were the same as rosiglitazone group. HE staining showed that the liver pathological damage was alleviated in the rats in Huangjin Capsules groups， and the most significant reduction was observed in the high-dosage group. Conclusion Huangjin Capsules can inhibit theup-regulation of expressions of eIF2 and GRP78 in liver tissue of model rats and reduce pathological damage， so as to improve the liver endoplasmic reticulum stress and reduce blood glucose.

Keywords： Huangjin Capsules; type 2 diabetes mellitus; endoplasmic reticulum stress; rats

2型糖尿?。═2DM）是由多種原因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性、系統性疾病，其病理機制是胰島素分泌不足和/或胰島素抵抗（IR）[1-2]。目前研究顯示，內質網應激（ERS）、IR與糖尿病的發生密切相關[3-4]。黃金膠囊由溫膽湯化裁而來，全方具有清熱解毒、運脾化濁功效。前期研究顯示，黃金膠囊能降低血糖，改善IR[5-6]。本實驗通過觀察肝組織ERS標志分子eIF2α、GRP78的表達，探討黃金膠囊治療T2DM的可能作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

雄性Wistar大鼠60只，SPF級，體質量（200±20）g，2～3月齡，甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

黃金膠囊（黃連9 g，雞內金12 g，法半夏9 g，竹茹15 g，枳實9 g，陳皮9 g，茯苓15 g，炙甘草9 g），甘肅中醫藥大學附屬醫院，批號171103;羅格列酮片，重慶涪陵制藥廠有限公司，批號20170203。

1.3? 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號641J03），eIF2α（GeneTex，批號42774），GRP78（GeneTex，批號42606）。臺式電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司，型號DZF-OB），Western blot轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6D），Western blot電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6D），搖床（德國IKA，型號SK-O180-E），酶標儀（美國BIO-RAD，型號iMark），恒溫培養箱（澳柯瑪股份有限公司，型號BC/BD-208HNE），血糖儀（美國強生，型號02211601B），滅菌鍋（上海申安醫療器械廠，型號LDZX-50KBS），高速低溫臺式離心機（德國Eppendorf公司，型號TGL-16），超低溫冰箱（美國Thermo，型號DW-HL528），實時定量PCR儀（美國Agilent，型號Applied Biosystems Step One PlusTM），渦旋振蕩器（美國賽洛捷克，型號MX-S），小型離心機（美國賽洛捷克，型號D1008E），NanoDrop核酸濃度測量儀（美國Thermo，型號NanoDropOne）。

2? 實驗方法

2.1? 分組、造模及給藥

普通飼料適應性喂養1周，禁食12 h，尾靜脈采血測空腹血糖。血糖4.77～7.77 mmol/L大鼠入選[7]，其中5只大鼠不達標。入選的55只大鼠按體質量編號，按隨機數字表法分為正常組8只、造模組47只，造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養，正常組給予普通飼料喂養[8]。自由飲水，飼養4周后，記錄大鼠體質量，造模組大鼠空腹12 h，單次腹腔注射STZ 35 mg/kg，72 h后測定大鼠血糖，空腹血糖（FBG）≥11.0 mmol/L或餐后血糖≥16.7 mmol/L大鼠納入模型實驗組，STZ注射后2周末復測大鼠血糖，未達標者均剔除，不作為實驗用鼠。將成模大鼠隨機分為模型組、羅格列酮組和黃金膠囊高、中、低劑量組，每組8只，成模大鼠均繼續給予高糖高脂飼料喂養，正常組給予普通飼料喂養，按人與大鼠體表面積折算及前期實驗研究[6]予相應劑量藥物，黃金膠囊高劑量2.025 g/kg、中劑量1.265 g/kg、低劑量0.675 g/kg，羅格列酮0.5 mg/kg，正常組和模型組給予等量生理鹽水。每日1次，連續10周。

2.2? 指標檢測

灌胃結束后，隔夜禁食、禁水12 h，采血測FBG;取肝組織置于凍存管，-80 ℃冰箱保存備檢。

2.2.1? RT-PCR檢測eIF2α、GRP78 mRNA表達

采用Trizol法從大鼠肝組織中提取RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用兩步法PCR反應程序：95 ℃、120 s;95 ℃、30 s，60 ℃、60 s，40個循環，以β-actin為內參，用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。引物序列見表1，引物設計合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2.2.2? Western blot檢測eIF2α、GRP78蛋白表達

取200 mg冷凍的肝組織樣本提取組織蛋白，BCA法行蛋白定量，蛋白樣本變性，SDS-PAGE，轉膜，免疫雜交反應，最后曝光顯影觀察，運用Quantity One軟件進行光密度定量分析，以各目的蛋白條帶灰度值與相應內參的條帶灰度值比計算各目的蛋白相對表達量。

2.2.3? HE染色

取肝組織4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察肝組織病理形態學變化。

3? 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析，計量資料以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較用LSD法，若方差不齊時用Games-Howell方法分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 黃金膠囊對大鼠空腹血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠FBG明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊各劑量組大鼠FBG明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;黃金膠囊中、低劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統計學意義（P<0.05）;黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。

4.2? 黃金膠囊對大鼠肝組織eIF2α、GRP78 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織eIF2α、GRP78 mRNA表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊各劑量組大鼠肝組織eIF2α mRNA表達明顯降低（P<0.05），黃金膠囊中、低劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統計學意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當，差異無統計學意義（P>0.05）;與羅格列酮組比較，羅格列酮組和黃金膠囊高、中劑量組GRP78 mRNA表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與羅格列酮組比較，黃金膠囊中劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統計學意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3。

4.3? 黃金膠囊對大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊組大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），黃金膠囊中、低劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統計學意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表4、圖1。

4.4? 黃金膠囊對大鼠肝組織病理形態的影響

正常組大鼠肝小葉結構清晰，肝索排列規則，細胞核結構清晰，染色均勻，未見明顯的脂肪變性、壞死，無界面性炎癥及纖維化;模型組大鼠肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，染色變淺，肝細胞體積變大，出現明顯的氣球樣變性，并伴有大量的炎性細胞浸潤及肝組織脂肪沉積;羅格列酮組大鼠大部分肝小葉結構接近正常，肝細胞排列較為整齊，偶見少量炎性細胞浸潤，可見少量肝細胞氣球樣變性及脂肪性病變，肝臟脂肪組織沉積明顯減少，較模型組病變程度明顯減輕;黃金膠囊各劑量組大鼠肝小葉結構逐漸清晰，肝索排列基本規則，肝細胞氣球樣變性及脂肪性病變明顯減輕，炎細胞浸潤及肝組織脂肪沉積均明顯減少，黃金膠囊高劑量組改善最明顯。見圖2。

5? 討論

研究顯示，胰島素與胰島素受體結合后主要通過2條途徑將信號下傳至效應器：一是經胰島素受體底物（IRS）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的代謝信號通路;另一個通路是經促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）調節基因轉錄、細胞增殖的生長信號通路[9-10]。研究發現，ERS可通過影響上述2條信號通路誘導肝臟IR的形成，促進T2DM的發生[11]。

內質網是哺乳動物細胞重要的Ca2+貯存器，也是蛋白質合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所[12]。某些情況下如缺氧缺血、高血糖、化學毒物等使內質網腔Ca2+耗竭、蛋白質糖基化抑制、二硫鍵錯配，均可導致未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網腔中蓄積，發生ERS。GRP78是促進蛋白質正確折疊的重要分子伴侶，GRP78表達上調是ERS的重要標志之一。發生ERS時，PERK與GRP78解離后，發生自身磷酸化，并使eIF2α磷酸化，阻止新蛋白質的合成。PERK與eIF2α的磷酸化被認為是發生ERS的標志[13-15]。

中醫認為，人體是一個有機整體，五臟六腑功能協調，氣血化生有源，則病無由以生;若外感六淫或七情致五臟六腑功能失調，氣、血、津液運化失常，痰、飲、濁、瘀等停滯，對機體產生毒害作用而致發病，這種有形的病理產物皆可稱為濁毒。情志失調，肝氣郁結，橫逆克犯脾土，致脾胃虛弱，運化失司，痰飲由生;肝氣不舒，久郁化火，木火邢金，煎津成痰;肝氣郁結，脾胃失司，氣機運行受阻，血之統帥作用減弱，血停不運而為瘀;氣血停滯，脈道受阻，瘀血內生而化為血濁。濁毒既是致病因素，又是病理產物，可流注于四肢關節、臟腑百骸而致病。濁毒流于肝臟，影響肝的正常生理功能，而引發肝臟內質網應激，產生IR，致糖尿病的發生和發展。

黃金膠囊切合糖尿病濁毒病理機制，方中黃連味苦性寒，歸心、脾、胃、膽、大腸經，清熱燥濕、瀉火解毒、止消渴，雞內金甘、平，歸脾、胃、小腸、膀胱經，具有醒脾消食、化積滯、縮小便之功，二者共為君藥，對于脾胃一瀉一補，對于痰濁一解一化，標本兼治，起到化濁解毒之功效，以治消渴;法半夏體滑而性燥，健脾燥濕，溫胃降逆，竹茹開胃土之郁，清肺金之燥，膽和則煩嘔自止，陳皮以辛散之，以苦燥之，調中而快膈，消痰而導滯，枳實破氣，痰化而痞脹消，四者共為臣藥;茯苓為佐，味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經，具有益脾除濕、利竅寧心之功，脾健而痰無以生;炙甘草味甘氣溫，補三焦元氣而散表寒，調和諸藥，為使藥。全方寒溫并用，補瀉兼施，達到清熱解毒、運脾化濁之效。

本實驗采用高脂高糖飼料喂養加腹腔注射鏈脲佐菌素制作T2DM大鼠模型。病理結果顯示，模型組大鼠肝臟出現明顯的病理損害，作為ERS發生的分子標志，eIF2α、GRP78蛋白與mRNA表達均明顯升高，表明內質網功能紊亂對肝細胞功能造成影響進而導致肝臟病理損害的發生，T2DM大鼠肝臟ERS程度較正常大鼠顯著增強。與模型組比較，黃金膠囊各劑量組大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白及mRNA表達明顯降低，肝臟病理損害明顯改善，提示黃金膠囊可通過降低eIF2α、GRP78表達起到保護肝組織ERS的作用。

綜上所述，鏈脲佐菌素誘導的T2DM模型大鼠肝組織中存在eIF2α、GRP78基因表達的異常，黃金膠囊通過降低eIF2α、GRP78表達而改善ERS，從而發揮其治療T2DM的作用。

參考文獻：

[1] 葛均波，徐永健.內科學[M].8版.北京：人民衛生出版社，2013：733.

[2] 余克花，李琳，王夢珂.lncRNA uc.48+對2型糖尿病大鼠肝糖原的影響[J].中國藥理學通報，2019，35（2）：187-191.

[3] 陳家倫.臨床內分泌學[M].上海：上海科學技術出版社，2011：1250.

[4] 趙玄燁，秦潔.內質網應激在代謝相關疾病發生中的作用機制及干預治療作用研究進展[J].山東醫藥，2019，59（15）：104-106.

[5] 康學東，黨曉娟，余臣祖，等.黃金膠囊改善糖尿病胰島素抵抗與PI-3K，GLUT4蛋白的表達[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（23）：133- 138.

[6] 余臣祖，安小平，康學東，等.黃金膠囊對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（3）：199-201.

[7] 崔淑芳.實驗動物學[M].上海：第二軍醫大學出版社，2007：303.

[8] 田小梅，田梅晞.混合喂養法誘導營養性肥胖大鼠模型的實驗研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2012，20（3）：429-430.

[9] KRATOCHVILOVA K， MORAN L. The role of the endoplasmic reticulumstress in stemness，pluripotency and development[J]. Eur J Cell Biol，2016，95（3/4/5）：115-123.

[10] 李丹丹，劉佳佳，吳玉泓，等.黃芪多糖聯合二甲雙胍對衰老2型糖尿病模型小鼠肝臟糖脂代謝的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2019， 26（2）：47-51.

[11] FLAMMENT M， HAJDUCH E， FERRE P， et al. New insights into ER stress-induced insulin resistance[J]. Trends Endocrinol Metab Tem，2012，23：381-390.

[12] MARCHI S， PATERGNANI S， MISSIROLI S， et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death[J]. Cell Calcium，2018，69：62-72.

[13] 鄭璐，韓冰，湯雷.內質網應激誘導的自噬對肝細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志，2019，35（2）：332-339.

[14] 吳雨婷，李葉麗，付舒，等.淫羊藿次苷Ⅱ通過改善內質網應激和caspase-12信號改善SHR大鼠左心室功能[J].中國藥理學通報，2019， 35（4）：571-575.

[15] 胡守玉，梁麗娜，戰麗彬，等.滋補脾陰方藥對脾陰虛糖尿病大鼠大腦皮質內質網應激的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2014，21（1）：46-53.

（收稿日期：2019-06-06）

（修回日期：2019-07-09;編輯：華強）

基金項目：甘肅省自然科學基金（1610RJZA074）

通訊作者：張朝寧，E-mail：1754648867@qq.com