芳香新塔花對動脈粥樣硬化模型小鼠Toll 樣受體-4/核因子-κB 信號通路的影響

張華，馬學寬，王思靜，張選明，倪昀，王麗，安冬青

芳香新塔花（新塔花）為唇形科半灌木狀植物新塔花的地上部分，又名唇香草，在我國主要分布在新疆、內蒙古等地區。新塔花全草中的化學成分主要為揮發油、非揮發油兩部分，新塔花揮發油為透明淡黃色油狀液體，約占全草的2%，國外有學者采用氣質聯用法和氣相色譜法進行化學分析，發現了其中27 種成分，主要包括胡薄荷酮（44.5%）、萜品醇（14.5%）等，非揮發油主要以總黃酮類為主[1-2]。近些年，新塔花在國內外受到廣泛關注，大量研究表明，新塔花成分具有抗炎止痛、舒張血管、降血壓、抗氧化、改善心肌缺血等作用[3-9]，主要用于治療失眠、高血壓、冠心病等疾病，但其作用機制尚不明確[5,10]。目前關于新塔花抗動脈粥樣硬化（AS）的研究國內外文獻報道較少，本研究運用蘇木精-伊紅（HE）染色法、實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法（Western Blot）探討了新塔花防治AS 的炎癥機制。

1 材料與方法

實驗動物：選取40 只8 周齡雄性載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠，10 只同品系C57 普通小鼠，平均體重（18.0±2.0）g，均購于北京維通利華公司；飼養于新疆醫科大學醫學動物中心。

試藥與儀器：新塔花全草購自亳州市中正中藥材飲片有限公司，并由專人鑒定；HE 染色試劑盒、阿托伐他汀購自北京Solarbio 公司；逆轉錄試劑盒、蛋白Marker 購自美國Thermo 公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；熒光定量PCR 試劑盒購自德國Qingen 公司。

新塔花水提物的制備：取干燥新塔花24.0 g，粉碎后置于圓底燒瓶中，加入200 ml 蒸餾水，加熱回流2 h，水提率為75%。洗滌濾渣，將所得有效水提物繼續真空懸蒸加熱1 h，得新塔花水提物80 ml，定容至100 ml 即為所需新塔花高劑量（含生藥0.18 g/ml），稀釋1 倍為低劑量（含生藥0.09 g/ml）。

模型的建立[11]：所有小鼠SPF 級環境適應性喂養1 周后，高脂飼料繼續喂養12 周用于建立動脈粥樣硬化模型。高脂飼料配方：基礎飼料82.68%，豬油10%，豬膽鹽0.2%，膽固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%。

分組及給藥：適應性喂養結束后，將C57 小鼠設為空白對照組；ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、他汀組、新塔花高劑量組和新塔花低劑量組，每組10只。同時給予5 組小鼠每天灌胃1 次，持續12 周：空白對照組和模型組均給予蒸餾水（0.4 ml/10 g），他汀組給予阿托伐他汀[3.0 mg/（kg·d）]，新塔花高劑量組給予新塔花水提物[1.8 g/（kg·d）]，新塔花低劑量組給予新塔花水提物[0.9 g/（kg·d）]。小鼠給藥量根據公式g/（kg·d）=9.1×成人臨床藥量[g/（kg·d）]換算；每周根據小鼠體質量變化調整劑量。

體質量變化觀察：在小鼠灌胃前及灌胃第2 周、6 周、12 周稱取體質量并記錄，后期分析各組小鼠體質量變化情況。

標本采集：小鼠灌胃第12 周末，禁食不禁水12 h，麻醉后無菌條件取胸主動脈置于4%多聚甲醛固定，之后HE 染色，用于病理切片實驗觀察小鼠主動脈病理變化；腹主動脈置于凍存管中迅速投入液氮，轉至-80 ℃冰箱，用于檢測Toll 樣受體-4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）的信使RNA（mRNA）相對表達水平和TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白表達水平。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：取凍存管內小鼠主動脈組織，依次經過Trizol 法提取RNA、濃度測定、逆轉錄、qRT-PCR 等步驟。由生工生物工程（上海）股份有限公司設計β-肌動蛋白（β-actin）、TLR4、NF-κB 引物序列：β-actin上 游5'-TGGCACCCAGCACAATGA A-3'，下 游5'-CTA AGTCATAGTCCGCCT AGAAGCA-3'；TLR4 上游5' -GTT CTT CTC CTG CCT GAC-3'，下游 5'-TGC TGA GTT TCT GAT CCA T-3'；NF-κB上 游5'-CCCAGGGTATGGCTACTC-3'，下 游5'-CATCACTCTTGGCACAATCT-3'。以 β-actin作為內參，通過2-△△Ct法比較各組小鼠腹主動脈組織中TLR4、NF-κB 的mRNA 相對含量。

Western Blot 法：取凍存管內主動脈組織，經過提取蛋白、濃度測定、蛋白定量、凝膠電泳制備、上樣、電泳、轉膜、免疫反應、顯色、終止、拍照等實驗步驟。后期運用Image J 處理軟件分析目的條帶的灰度值，計算TLR4、磷酸化NF-κB p65 與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的相對表達量。

統計學方法：數據采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，多組比較用單因素方差分析，方差齊兩兩比較LSD 檢驗；方差不齊采用非參數檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量變化（表1）

灌胃第2、6、12 周末，空白對照組小鼠飲食、飲水及二便正常，體質量增加不顯著；與空白對照組比較，模型組小鼠對外界刺激反應遲鈍，飲食、飲水降低明顯，體質量增加明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，他汀組、新塔花高劑量組小鼠對外界刺激反應有所緩解，飲食、飲水減少，平均體質量減少，差異均有統計學意義（P均＜0.01）；新塔花低劑量組小鼠體質量較模型組減少，但較他汀組增加（P均＜0.05）。

表1 各組小鼠體質量變化（g,±s）

表1 各組小鼠體質量變化（g,±s）

注：與空白對照組比**P＜0.01；與模型組比△P＜0.05，△△P＜0.01；與他汀組比▲P＜0.05

2.2 各組小鼠胸主動脈病理形態結構（圖1）

HE 染色結果可見，空白對照組小鼠胸主動脈壁未見明顯平滑肌細胞增生，腔內未見膽固醇結晶形成或明顯狹窄（圖1A）；模型組小鼠胸主動脈內斑塊增多，動脈壁厚度明顯不均勻，局部發生鈣化，外膜可見大量炎性細胞浸潤及斑塊形成（圖1B）；他汀組小鼠胸主動脈壁厚度不均，內膜增厚較模型組輕，且有少量斑塊形成且穩定（圖1C）；新塔花高劑量組小鼠主動脈管壁厚度不均勻，內膜增厚較模型組輕，外膜內可見少量炎性細胞浸潤及斑塊形成（圖1D）；低劑量組管腔壁厚度不均，內膜增厚明顯，可見斑塊形成，病理改變較模型組未見明顯改變（圖1E）。

2.3 各組小鼠腹主動脈TLR4、NF-κB 的mRNA 的相對表達水平情況（圖2）

qRT-PCR 結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈TLR4 mRNA[（1.04±0.38）vs（7.54±1.76），P＜0.01]、NF-κB mRNA[（1.07±0.16）vs（5.93±1.70），P＜0.01]相對表達水平升高；與模型組比較，他汀組、新塔花高劑量 組TLR4 mRNA[（7.54±1.76）vs（2.05±0.57），P＜0.01；（7.54±1.76）vs（3.84±1.06），P＜0.05]、NFκB mRNA[（5.93±1.70）vs（1.79±0.63），P＜0.01；（5.93±1.70）vs（2.04±0.94），P＜0.01]相對表達水平降低，新塔花低劑量組NF-κB mRNA[（5.93±1.70）vs（4.35±1.41），P＜0.01]相對表達水平下調；與他汀組比較，新塔花高劑量、低劑量組TLR4 mRNA[（2.05±0.57）vs（3.84±1.06）；（2.05±0.57）vs（5.94±2.04）]、NF-κB mRNA[（1.79±0.63）vs（2.04±0.94）；（1.79±0.63）vs（4.35±1.41）]相對表達水平較高，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

圖1 各組小鼠胸主動脈蘇木精-伊紅染色結果（×200，n=10）

圖2 各組小鼠腹主動脈TLR4、NF-κB 的mRNA 相對表達水平情況（±s,n=6）

2.4 各組小鼠腹主動脈中TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白相對表達水平比較（圖3）

Western Blot 結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠腹主動脈TLR4 [（0.68±0.16）vs（1.35±0.11），P＜0.01]、磷酸化NF-κB p65[（0.61±0.08）vs（1.42±0.14），P＜0.01]蛋 白相對表達水平上調；與模型組比較，他汀組、新塔花高劑量和低劑量組TLR4 [（1.35±0.11）vs（0.90±0.10）；（1.35±0.11）vs（0.81±0.10）；（1.35±0.11）vs（0.84±0.12）]、磷 酸 化NF-κB p65 [（1.42±0.14）vs（0.88±0.08）；（1.42±0.14）vs（0.92±0.14）；（1.42±0.14）vs（1.21±0.13）]蛋白相對表達水平下調，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

圖3 各組小鼠主動脈TLR4、P-p65 蛋白相對表達水平的比較（±s,n=5）

3 討論

近些年，心血管疾病已成為全球人口死亡的首要原因，其發病率呈升高趨勢，目前我國心血管病現患人數 2.9 億，而動脈粥樣硬化是缺血性心血管疾病的主要病理因素[12-13]。研究表明，動脈粥樣硬化在不同的病理生理過程始終伴隨炎癥反應。當組織受損時，誘導免疫反應從而激活TLR4，介導下游因子，激活NF-κB 磷酸化，誘導產生一系列炎性因子，從而發生炎癥反應，導致內皮功能障礙，促使動脈粥樣硬化的發生發展[14-17]。

眾所周知，他汀類藥物具有調脂、抗炎等效果，能有效抗動脈粥樣硬化，降低心血管疾病患者心血管事件的發生風險。本研究結果顯示，高脂飼料喂養可成功建立動脈粥樣硬化小鼠模型，而新塔花高劑量組小鼠體質量較模型組降低，主動脈炎性浸潤及脂質沉淀減少，未見明顯斑塊，血管內皮病理情況緩解，提示新塔花能夠降低動脈粥樣硬化小鼠體質量，改善內皮功能，減輕炎癥反應。本研究還發現，新塔花高劑量組小鼠腹主動脈TLR4、NFκB mRNA 相對表達水平較模型組降低；TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白相對表達水平較模型組下調，與阿托伐他汀組比較，差異無統計學意義，這提示新塔花可能是通過降低TLR4/NF-κB 信號通路內蛋白水平，最終達到抑制炎癥反應，防治動脈粥樣硬化的效果。本研究結果還表明，新塔花作用程度雖然未達到他汀類藥物的效果，但同樣具有抑制炎癥、改善內皮作用，且新塔花高劑量組比低劑量組效果更加明顯，提示新塔花作用于小鼠主動脈TLR4/NF-κB 通路時，具有一定的藥物劑量依賴性。

總之，該實驗對新塔花應用于防治動脈粥樣硬化性心血管疾病進行了探索和支持。但是，新塔花哪些成分起到了靶向作用，還需進一步對藥效學和機制展開研究。