廢水處理污泥中鄰苯二甲酸酯降解菌的多樣性研究*

王 群 方程冉# 陳 亮

(1.浙江科技學院環境與資源學院，浙江省廢棄生物質循環利用與生態處理技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018)

隨著塑化劑鄰苯二甲酸酯(PAEs)在日用品、建筑材料、醫藥、化妝品等生產行業的廣泛應用，其在環境中的殘留、分布及對生態系統的危害被日益關注[1]。據統計，PAEs在全球的年消費量高達680萬t[2]，由于PAEs與化合物的結合方式為物理結合，導致其較易釋放進入環境，該釋放過程可發生于塑料產品的生產、使用和丟棄等過程中[3]。目前，在土壤、河水、海水、沉積物和生物群中均發現PAEs的存在[4]，其在環境中長期賦存會對生物體產生毒害效應。PAEs中應用較廣泛的為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)，由于其致癌性、致畸性和致突變性[5]，DBP和DEHP已被美國環境保護署列為優先控制污染物[6]。

土壤、河水、海水甚至飲用水源中的PAEs污染問題和污水的處理、排放密切相關[7]。目前，中國污水排放標準明確規定了常規生化指標和重金屬含量，但PAEs等有機污染物不在其列。因此，即使污水達標排放，PAEs仍會隨污水進入水環境系統，并對周圍土壤造成污染。

在中國，除農用大棚和塑料薄膜的使用可直接導致PAEs污染土壤外[8]，大部分含有PAEs的塑料制品廢棄物多通過垃圾堆放、填埋和后期污水處理進入環境[9]。生活、醫療和工業垃圾經過長期堆放后，PAEs可從塑料制品中釋放，加上雨水的沖刷進入垃圾滲濾液。包含垃圾滲濾液在內的多種污廢水是PAEs的主要匯集場所，因此只有在污水處理環節中有效去除PAEs，才能避免污水排放后PAEs對周邊環境的二次污染[10]。污水處理中的生物降解是去除各類有機污染物的關鍵因素[11]。目前，關于污水處理系統中PAEs降解菌的多樣性和PAEs對污水處理系統中微生物群落結構的影響鮮有報道。本研究系統探究了常規廢水處理污泥對典型PAEs的微生物群落響應特征和污泥中PAEs降解菌的多樣性，為PAEs降解菌的實際應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 污泥取樣

廢水處理污泥取自浙江省紹興市某污水處理廠的好氧池，該廠長期處理化工和印染廢水。新鮮污泥樣經沉淀和離心去除水分后，4 ℃保存備用。

1.2 主要培養基和試劑

基礎鹽培養基：1.00 g/L KH2PO4，7.04 g/L Na2HPO4·12H2O，0.10 g/L MgCl2·6H2O，1 mL微量元素母液，pH 7.2。

微量元素母液：2.138 5 g/L FeSO4·7H2O，0.1 g/L ZnSO4·7H2O，0.03 g/L MnCl2·4H2O，0.3 g/L H3BO4，0.286 8 g/L CoCl2·6H2O，0.02 g/L NiCl2·6H2O，0.03 g/L Na2MoO4·2H2O，pH 4.0。

DBP、DEHP均為色譜級試劑，其他試劑均為分析純試劑。

1.3 PAEs降解菌富集培養

針對DBP和DEHP分別進行富集培養，每組實驗設置：取5 g廢水處理污泥置于200 mL基礎鹽培養基中，添加100 mg/L DBP或DEHP作為碳源，置于30 ℃、200 r/min搖床培養5 d，轉接至含有400 mg/L DBP或DEHP的基礎鹽培養基中繼續培養5 d，再連續轉接兩輪(DBP或DEHP質量濃度梯度為700、1 000 mg/L)。

1.4 DNA提取和序列擴增

采用十六烷基三甲基溴化銨法[12]對樣本的基因組DNA分別進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，樣品DNA稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行聚合酶鏈反應(PCR)，確保擴增效率和準確性，PCR擴增引物序列及對應區域見表1。

1.5 Hiseq測序和數據處理

使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns試劑盒構建文庫，經過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL上機測序；測序數據經過Cutadapt(V1.9.1，http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)進行低質量部分剪切，再截去Barcode和引物序列后，初步得到原始數據；去除原始序列中的嵌合體序列(http://www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html)后，得到最終有效數據。

1.6 數據分析

1.6.1 可操作分類單元(OTUs)聚類和物種注釋

利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)對所有數據進行聚類分析，具有97%及以上一致性的序列歸為一個OTUs；用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSU rRNA數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋，獲得分類學信息并分別在界、門、綱、目、科、屬、種水平統計群落組成。

1.6.2 組間群落相似性分析

基于測序數據和OTUs聚類分析結果，使用Qiime軟件計算Unifrac距離，進行非加權組平均法樣品聚類分析。使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包進行主成分分析(PCA)，以反映組間群落相似性，并分別進行參數和非參數檢驗，檢驗方法選用Tukey和wilcox檢驗。

1.6.3 菌群豐度和系統發育多樣性分析

先使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算菌群豐度指數和系統發育多樣性指數。再使用R軟件進行菌群豐度和系統發育多樣性分析，并分別進行參數和非參數檢驗，檢驗方法選用Tukey和wilcox檢驗。

2 結果與討論

2.1 DBP和DEHP降解效率

實驗證明，4輪富集培養后得到的富集菌液對DBP和DEHP的降解效果較佳。富集菌液對DBP和DEHP的降解效率見圖1。當DBP和DEHP為1 000 mg/L時，其在培養第6天的降解率分別達到57.1%和36.0%；經過10 d培養后，富集菌液對DBP、DEHP的降解率分別可達99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP，與文獻[13]一致，而原因是DEHP含有比DBP更復雜的支鏈結構。

表1PCR擴增引物序列及對應區域

圖1 富集菌液對DBP和DEHP的降解效率Fig.1 Degradation efficiency of DBP and DEHP by enriched bacteria solution

據報道，DBP和DEHP的降解均從酯水解開始，形成中間產物單酯(鄰苯二甲酸丁酯或鄰苯二甲酸乙酯)和相應的醇，單酯進一步被降解成為鄰苯二甲酸[14]。由于DEHP兩個酯鏈上各多出一個支鏈，導致其被降解為單酯的難度增強，是其降解速率比DBP慢的主要原因。

2.2 污泥菌群豐度及組間群落相似性分析

分別取原廢水處理污泥(簡稱RS組)和DBP、DEHP降解菌富集培養后污泥(分別簡稱DBP、DEHP組)進行Hiseq測序。OTUs聚類分析發現，DBP、DEHP組中OTUs數量顯著低于RS組，DBP、DEHP和RS組的OTUs數量分別為226、273和848，3個樣品組共有OTUs數量為205。DBP、DEHP組中分別有90.7%、75.1%的OTUs與RS組中僅24.2%的OTUs重疊。該結果進一步表明，富集培養過程中，DBP和DEHP的添加使廢水處理污泥中的微生物多樣性顯著降低。

本研究進一步對OTUs代表序列進行了物種注釋和組間群落相似性分析，基于OTUs水平的PCA見圖2。樣品的群落組成越相似，則它們在PCA中的距離越接近。DBP、DEHP組物種組成相似性較高，且均與RS組差異較大。

2.3 污泥中優勢菌群和PAEs降解菌的分布

基于菌群豐度分析結果，取相對豐度前10的優勢門類(見表2)詳細展示不同樣品組的物種豐度。變形菌門和擬桿菌門在所有樣品組中均占優勢，且RS組中相對豐度比DBP、DEHP組中低。在RS組中，放線菌門相對豐度也較高。通過Unifrac距離分析樣品間的相似性得知，DBP和DEHP組之間的物種豐度及優勢門類較相似，而DBP、DEHP組均與RS組相似度較低。

圖2 基于OTUs水平的PCAFig.2 PCA based on OTUs

表2 樣品組間優勢門類相對豐度

為探討污泥中PAEs降解菌的分布，在DBP、DEHP和RS組相對豐度排名前35的屬中選取并匯總了已被報道的具有DBP或DEHP降解能力的屬，結果見表3。在DEHP組中，優勢屬戈登氏菌屬、無色桿菌屬、紅球菌屬、根瘤菌屬和金黃桿菌屬中均被報道存在DEHP降解菌；在DBP組中，優勢屬代爾夫特菌屬、假單胞菌屬和鞘脂菌屬中均被報道存在DBP降解菌。戈登氏菌屬、紅球菌屬和根瘤菌屬還同時被報道存在DBP降解菌，表明許多具有DEHP降解能力的微生物菌株可能同時存在DBP降解能力；其余屬不具備同時降解DBP和DEHP的能力，進一步表明DEHP比DBP更難降解，該結果和DEHP存在更復雜的支鏈結構相關。鑒于DEHP更難被降解，微生物如果能有效降解DEHP，則其更容易降解結構相似且沒有復雜結構的DBP。系統發育多樣性分析表明，已報道的PAEs降解菌存在于多種優勢屬中，其相互間沒有明顯進化關系，該結論與已報道的研究結論一致，即在自然環境中PAEs降解菌存在高度的遺傳多樣性[23]。以上結果表明，廢水處理污泥中存在多種類型PAEs降解菌。高濃度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不斷增長，進而成為優勢微生物，最終達到DBP和DEHP的有效降解。但低濃度PAEs的污染仍會造成各類遺傳損傷[24]。因此，在復雜的環境中去除低濃度的PAEs仍是亟待解決的重要問題。

3 結 論

(1) 廢水處理污泥經過10 d培養后，對1 000 mg/L的DBP和DEHP的降解率分別可達99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP。

(2) DBP和DEHP的添加顯著降低了廢水處理污泥的微生物多樣性；DBP、DEHP組物種組成相似性較高，且均與RS組差異較大。

(3) 廢水處理污泥中存在多種類型PAEs降解菌。高濃度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不斷增長，進而成為優勢微生物，最終達到DBP和DEHP的有效降解。

表3DBP/DEHP降解菌的優勢屬分布1)

注：1)“-”表示非優勢屬；“+”表示優勢屬；“+++”表示優勢屬且豐度強；“Y”表示存在相應降解菌報道。