鹽單胞菌H17降解苯酚的響應(yīng)面法優(yōu)化及動力學(xué)*

母顯杰 丁舒心 趙娜娜 丁曉宇 許繼飛

(內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古環(huán)境污染控制與廢物資源化重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

苯酚是造紙、紡織和煤化工等產(chǎn)業(yè)的重要原料[1]，其作為一種原生質(zhì)毒物，隨工業(yè)廢水排放到環(huán)境中[2-3]，對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生危害，如水生生物大量死亡、人類肝功能及腎功能受損等[4]。美國環(huán)境保護(hù)署已把苯酚列為優(yōu)先控制污染物并對其含量提出嚴(yán)格控制要求[5-6]。印染、造紙及石油加工等工業(yè)廢水中不僅含有苯酚，還含有大量鹽分，這大大提高了含酚廢水的處理難度[7]。

目前對于高鹽含酚廢水的處理方法主要有生物降解、吸附、光催化和電化學(xué)氧化[8-11]，生物降解以其經(jīng)濟(jì)、高效、無二次污染而被廣泛采用[12]。由于高鹽環(huán)境會抑制微生物的生長，使一般的苯酚降解菌處理高鹽含酚廢水效果并不明顯，這大大限制了生物技術(shù)在高鹽含酚廢水處理中的應(yīng)用。嗜鹽苯酚降解菌能在高鹽條件下良好生長，直接降解苯酚，克服一般菌株在高鹽條件無法高效降解苯酚這一難題[13]52。以往對嗜鹽苯酚降解菌的降解性能研究主要集中在10%鹽度以下，且菌株對于高鹽含酚廢水的處理效果不佳。GAYATHRI等[14]分離的嗜鹽菌菌群在5%鹽度下，僅能完全降解50 mg/L的苯酚；王麗娟等[15]分離的芽孢桿菌(Bacillussp.)CCZU-R6只能耐受11%鹽度，在此鹽度下對500 mg/L苯酚的降解率不到10%。本研究所用的鹽單胞菌(Halomonassp.)H17(以下簡稱為H17)能在0～20%鹽度下有效降解200 mg/L苯酚，與其他菌株相比更具應(yīng)用價值。生物降解特性受多種因素影響，包括碳源、底物濃度、溫度、pH、鹽度等條件[16]，因此優(yōu)化相關(guān)條件對提升降解效率尤為重要。傳統(tǒng)的單因素實驗不能確定各因素的主次，而響應(yīng)面法可以在較少的試驗次數(shù)下預(yù)測各因素之間的交互作用，優(yōu)化試驗條件，提高降解效率[17-18]。本研究以H17為研究對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化該菌株降解苯酚試驗條件，并對降解過程進(jìn)行動力學(xué)擬合，以期為高鹽含酚廢水的生物處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

H17從巴丹吉林鹽湖的表層沉積物中篩選所得，實驗室冷藏保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

HM培養(yǎng)基[13]52：MgSO4·7H2O 1.00 g、NaCl 100.00 g、KCl 2.00 g、NaBr 0.23 g、NaHCO30.06 g、FeCl3·7H2O 0.05 g、CaCl2·2H2O 0.36 g、葡萄糖1.00 g、酵母提取物1.00 g、蛋白胨0.50 g、瓊脂15.00 g，pH為7.0～7.2。該培養(yǎng)基用于菌株培養(yǎng)及分離。

改良Gibbons培養(yǎng)基[19]：K2HPO40.65 g、檸檬酸三鈉 3.00 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、MnSO4·H2O 0.02 g、NaCl 10.00 g、Fe2(SO4)30.005 g、(NH4)2SO41.00 g、CaCl20.05 g、KH2PO40.50 g、酵母提取物0.20 g、胰蛋白胨0.20 g，添加過濾滅菌的苯酚，pH為8.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 環(huán)境條件對H17降解苯酚的影響

菌懸液以5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于苯酚初始質(zhì)量濃度200 mg/L的改良Gibbons培養(yǎng)基中，在不同溫度(15、20、25、30、35 ℃)、pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和葡萄糖質(zhì)量濃度(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L)等條件下165 r/min振蕩培養(yǎng)，60 h后取樣分析苯酚降解率，每組試驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.2 優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果將溫度、pH及葡萄糖濃度作為響應(yīng)面試驗自變量，以60 h苯酚降解率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法中Box-Behnken設(shè)計試驗，通過試驗數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型，確定最優(yōu)降解條件并進(jìn)行驗證。

1.3.3 降解苯酚動力學(xué)研究

在最佳培養(yǎng)條件下，將菌懸液以5%接種量接種于苯酚初始質(zhì)量濃度分別為0、100、200、400、600、800 mg/L的改良Gibbons培養(yǎng)基中，于30 ℃、pH=8.0、葡萄糖質(zhì)量濃度0.8 g/L下165 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔6 h取樣，分析苯酚降解速率。

1.4 分析方法

采用紫外分光光度法，測定稀釋樣在270 nm波長處的光吸收值，參照苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算苯酚濃度，并計算苯酚降解率。

采用紫外分光光度法，測定菌液在600 nm波長處的光吸收值，以此來表示菌體的生物量，再據(jù)此計算菌體細(xì)胞濃度[20]。

Haldane模型用于描述底物既是反應(yīng)基質(zhì)、又是抑制劑的生物降解過程[21]。因此，本研究選擇Haldane模型(見式(1))分析不同苯酚初始濃度下H17對苯酚的降解速率。

(1)

式中：μ為微生物比生長速率，h-1；μmax為最大比降解速率，h-1；Cs為底物初始質(zhì)量濃度，mg/L；Ks為飽和常數(shù)，mg/L；Ki為抑制常數(shù)，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對H17降解苯酚的影響

當(dāng)pH為8.0、葡萄糖質(zhì)量濃度為0.8 g/L時，溫度對H17降解苯酚的影響如圖1所示。溫度為15～35 ℃時，H17對苯酚的降解率變化呈拋物線型，在30 ℃時苯酚降解率達(dá)到最大值(72.03%)，溫度低于或高于30 ℃時，該菌株對苯酚的降解能力均下降，表明H17在30 ℃下能較好降解苯酚。溫度影響酶促反應(yīng)的速率，在最適溫度范圍內(nèi)反應(yīng)速率隨溫度的升高而加快，但溫度過高會使酶變性失活[22]，從而抑制菌株降解苯酚的效率。

圖1 溫度對H17降解苯酚的影響Fig.1 Effect of temperature on phenol degradation by H17

2.2 pH對H17降解苯酚的影響

當(dāng)溫度為30 ℃、葡萄糖質(zhì)量濃度為0.8 g/L時，pH對H17降解苯酚的影響如圖2所示。pH為7.0～8.0時，該菌株能較好降解苯酚，苯酚降解率為70%左右，而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，菌株對苯酚的生物降解作用受到抑制，可能是因為強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件影響生物體內(nèi)酶的穩(wěn)定性和苯酚化學(xué)毒性，從而改變底物分子和酶結(jié)合[23]，影響到H17對苯酚的降解。

圖2pH對H17降解苯酚的影響Fig.2 Effect of pH on phenol degradation by H17

2.3 葡萄糖濃度對H17降解苯酚的影響

當(dāng)溫度為30 ℃、pH為8.0時，葡萄糖質(zhì)量濃度對H17降解苯酚的影響如圖3所示。在改良Gibbons培養(yǎng)基中加入一定葡萄糖對該菌株降解苯酚的能力有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為0.8 g/L時，該菌株對苯酚的降解率達(dá)到了最大值(72.91%)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不添加葡萄糖時的苯酚降解率。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度大于0.8 g/L時，隨著葡萄糖濃度的升高，苯酚降解率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于葡萄糖濃度過高，導(dǎo)致H17優(yōu)先利用葡萄糖，從而降低苯酚利用率，這與周倩倩等[24]的研究結(jié)果基本一致。

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度對H17降解苯酚的影響Fig.3 Effect of glucose mass concentration on phenol degradation by H17

2.4 響應(yīng)面法對H17降解苯酚條件的優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計試驗，以溫度、pH和葡萄糖濃度作為影響H17降解苯酚的3個因素，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，試驗因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

表2Box-Behnken試驗設(shè)計及H17對苯酚的降解率實測值

2.4.2 模型的建立及顯著性分析

利用軟件Design Expert 8.0.5對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，以苯酚降解率(Y，%)為響應(yīng)值，得到的編碼方程模型見式(2)。

Y=73.78+0.17A+2.74B+1.21C+AB-0.81AC-0.70BC-3.47A2-3.48B2-3.60C2

(2)

式中：A為溫度，℃；B為pH；C為葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L。

由表3可知，編碼方程模型的p<0.000 1，說明該模型極顯著。模型失擬項p為0.123 3，p>0.05，模型失擬項不顯著，表明試驗結(jié)果與數(shù)學(xué)模型擬合良好。模型決定系數(shù)為0.991 8，表明pH、葡萄糖濃度和溫度對H17降解苯酚的影響占99.18%，說明模型的相關(guān)度較好，可用于該菌株降解苯酚最佳降解條件的優(yōu)化。分析可得，對H17降解苯酚產(chǎn)生影響的3個因素排序為pH>葡萄糖濃度>溫度。

表3Box-Behnken試驗回歸分析結(jié)果

2.4.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件的確定

各因素對響應(yīng)值的影響可能不是簡單的線性關(guān)系而是存在極值點，響應(yīng)曲面圖可直觀反映各因素之間的相互作用[25]。等高線可以反映出兩因素的交互作用是否顯著，等高線呈橢圓形表示兩個因素之間的作用顯著，等高線呈圓形則表示兩因素之間的作用不顯著[26-27]。由圖4至圖6可知，隨著溫度、pH、葡萄糖濃度升高，苯酚降解率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。pH與葡萄糖濃度、pH與溫度、葡萄糖濃度與溫度之間的交互作用均顯著。

圖4 葡萄糖質(zhì)量濃度與pH對苯酚降解率影響的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of glucose mass concentration and pH on the phenol degradation efficiency

通過對試驗?zāi)Ｐ鸵约绊憫?yīng)面分析，獲得H17降解苯酚的最佳條件為溫度30 ℃、pH=8.0和葡萄糖質(zhì)量濃度0.8 g/L，在此條件下苯酚降解率的預(yù)測值為74.39%。

2.4.4 模型驗證

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在預(yù)測的最佳條件下進(jìn)行苯酚降解試驗，將H17接種在含苯酚200mg/L的改良Gibbons培養(yǎng)基中，165 r/min培養(yǎng)60 h，得到的苯酚降解率為73.92%，與預(yù)測值74.39%偏差很小，表明該模型可有效優(yōu)化和預(yù)測該菌株降解苯酚的條件。可見，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的降解條件準(zhǔn)確，可為高鹽含酚廢水處理提供依據(jù)。

圖5pH與溫度對苯酚降解率影響的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface of pH and temperature on the phenol degradation efficiency

圖6 葡萄糖質(zhì)量濃度與溫度對苯酚降解率影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface of glucose mass concentration and temperature on the phenol degradation efficiency

2.5 H17降解苯酚動力學(xué)

H17比生長速率與苯酚初始質(zhì)量濃度之間的關(guān)系如圖7所示，符合Haldane模型(相關(guān)系數(shù)為0.998 0)，H17降解苯酚的最大比降解速率、飽和常數(shù)和抑制常數(shù)分別為0.35 h-1、165.91 mg/L和460.13 mg/L。通過方程求導(dǎo)得出最大比生長速率所對應(yīng)的苯酚初始質(zhì)量濃度為276 mg/L，即該菌株降解苯酚的最適初始質(zhì)量濃度。從圖7可知，當(dāng)苯酚初始質(zhì)量濃度為0～276 mg/L時，隨著苯酚初始濃度增大，H17的比生長速率隨之提高；當(dāng)苯酚初始質(zhì)量質(zhì)量濃度大于276 mg/L時，其比生長速率隨苯酚初始濃度增大呈下降趨勢，出現(xiàn)底物抑制作用，這主要是因為苯酚濃度過高抑制了菌株同化作用，降低了菌體比生長速率[28]。

圖7H17苯酚降解動力學(xué)Fig.7 Phenol degradation kinetics of H17

抑制常數(shù)能反映底物對菌株抑制作用的大小，其值越大，菌株耐受的底物濃度越大[29]。H17的抑制常數(shù)(460.13 mg/L)明顯大于SINGH等[30]報道的苯酚降解菌粘鞭霉菌(Gliomastixindicus)MTCC 3869(43.28 mg/L)和葛啟隆等[31]所報道的Diaphorobactersp. PDB3(146.72 mg/L)，表明H17對苯酚有較強(qiáng)的耐受能力。

3 結(jié) 論

(1) 溫度、pH和葡萄糖濃度對H17降解苯酚均有顯著影響，響應(yīng)面法確定的H17降解苯酚最優(yōu)條件為pH=8.0、溫度30 ℃、葡萄糖質(zhì)量濃度0.8 g/L，苯酚實際降解率可達(dá)73.92%。

(2) H17對苯酚的降解動力學(xué)符合Haldane模型，其最大比降解速率、飽和常數(shù)和抑制常數(shù)分別為0.35 h-1、165.91 mg/L和460.13 mg/L。