CHO細胞表達抗血管內皮生長因子單克隆抗體工藝優化

馮 煒，史勁松

江南大學 藥學院，無錫 214122

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生長因素，可提高血管的通透性[1]，是誘導腫瘤血管形成的作用最強、特異性最高的血管生長因子[2]。因此，抑制血管內皮生長因子可以抑制腫瘤的生長[3]。抗VEGF治療的第一代藥物是諾華公司的Lucentis和羅氏公司的Avastin，前者價格昂貴，而后者價格低廉，在很多國家作為非標簽用藥，市場巨大[3, 4]。抗VEGF治療的第二代藥物是德國拜耳的Eylea和我國成都康弘生物科技有限公司的朗沐，此類藥物是一種融合蛋白，可以與VEGF競爭性結合VEGF受體，抑制VEGF產生作用，作用比第一代的抗VEGF藥物更強。Eylea目前在海外市場已經占據相當大的市場份額，而朗沐在我國已開始臨床三期試驗，表現出顯著的治療效果[5-8]。然而，前兩代抗VEGF治療的藥物都只適用于眼底病治療的藥物，應用范圍受到很大的限制。近年來，單克隆抗體類藥物發展迅猛，已被廣泛用于惡性腫瘤、免疫學疾病和罕見病等多個適應癥的治療[9]，目前已有超過300種單克隆抗體藥物處于臨床試驗階段[10]。與第一代和第二代抗VEGF藥物相比，抗VEGF單克隆抗體的應用范圍更加廣泛。本研究利用已經構建好的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)細胞株表達抗VEGF人源化單克隆抗體(VEGF-MA)，并對培養基和培養條件進行優化，以期獲得更高的目的蛋白產量。

1 材料與方法

1.1 細胞株

本研究所用細胞株為重組CHO細胞。目的產物為VEGF-MA，93%的序列為人源，7%的序列為鼠源(位于可變區的互補決定區CDR)，每個輕鏈由214個氨基酸組成，每個重鏈由453個氨基酸組成，相對分子量為149 000。

1.2 培養基

(1) 基礎培養基：本研究選取14種基礎培養基，編號以及濃度如表1所示。

表1 基礎培養基

(2) 補料培養基：本研究選取10種補料培養基，編號以及濃度如表2所示。

表2 補料培養基

(3) 外源添加物：本研究選取7種能夠促進VEGF-MA表達的外源添加物，為方便添加，將其配制成溶液，溶液濃度以及編號如表3所示。

表3 外源添加物

1.3 細胞培養

1.3.1細胞復蘇及搖瓶擴增

從液氮罐中取出凍存細胞37 ℃水浴解凍，將解凍后的凍存液轉入裝有8.5 mL CD CHO培養基的離心管中，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清。將細胞沉淀重新懸浮于5 mL CD CHO培養基中，以0.30×106個/mL～0.90×106個/mL的密度接種于裝有25 mL CD CHO培養基的250 mL三角瓶中。將三角瓶置于CO2搖床中培養，CO2濃度、溫度和轉速分別為6%、36.5 ℃和130 r/min。每三天對搖瓶中的細胞計數一次，按(0.4×106～0.6×106)個/mL的密度接種至新鮮培養基，逐級傳代擴增至0.25 L～2 L搖瓶中。

1.3.2搖瓶培養

用基礎培養基將細胞按一定的接種細胞密度接入250 mL擋板搖瓶中，接種體積80 mL，搖床培養參數為：6% CO2，36.5 ℃，130 r/min。其他工藝參數按照實驗設計進行設定。按相關實驗方案進行補料，補料體積為初始培養重量的4%，外源添加物體積為初始培養重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時，添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據通氣產生的泡沫情況，適量添加消泡劑。

1.3.33 L發酵罐培養

用基礎培養基將搖瓶種子細胞按一定比例稀釋至接種細胞密度設定值，接入3 L發酵罐，發酵罐初始培養體積1.0 L。設置發酵罐攪拌轉速為280 r/min，DO設定值為40%，與O2通氣量進行關聯控制，氧氣通氣流量范圍為(0～500) mL/min，根據活細胞密度調整空氣流量設定值，空氣流量控制范圍為(10～100) mL/min。其他工藝參數按照實驗設計進行設定。pH通過添加通碳酸氫鈉溶液和CO2進行關聯調節。每天取樣檢測活細胞密度、細胞活率，第3 d、5 d、7 d、9 d、11 d補料，補料體積為初始培養重量的4%，外源添加物體積為初始培養重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時，添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據通氣產生的泡沫情況，適量添加消泡劑。

1.4 檢測方法

1.4.1VEGF-MA濃度檢測

VEGF-MA濃度檢測方法見參考文獻[11]。

1.4.2VEGF-MA純化

VEGF-MA純化方法見參考文獻[12,13]。

1.4.3糖基化水平檢測

糖基化水平檢測方法見參考文獻[14-16]。

1.4.4蛋白純度檢測

蛋白純度檢測方法見參考文獻[14-16]。

1.4.5電荷異質性檢測

電荷異質性檢測方法見參考文獻[14-16]。

2 結果與討論

2.1 培養基優化

2.1.1基礎培養基優化

首先選取14種細胞培養中常用的基礎培養基，種類如表1所示。分別在不同的培養基中培養CHO細胞，考察抗VEGF抗體的生產性能，目的在于選擇最優的基礎培養基。目的蛋白產量是體現生產性能的主要指標，在上述14種基礎培養基中培養CHO細胞7 d后，發酵液中的VEGF-MA濃度如圖1所示。從中可以看出，最優的批次所使用的基礎培養基為5#，VEGF-MA的產量為0.70 g/L。此外，使用7#、9#和11#三種基礎培養基時，也可以獲得較高的目的蛋白產量(0.60 g/L以上)。除目的蛋白產量外，目的產物質量也是體現生產性能的重要指標。目的產物質量可以依靠其電荷異質性、糖基化組分和蛋白純度三個指標判斷。通常情況下，電荷異質性≤35.0%、糖基化組分處于50.0%～60.0%之間以及蛋白純度≥85.0%的目的產物被認為質量合格。在上述14個批次結束時刻的發酵液中分離純化抗VEGF抗體，測定其電荷異質性、糖基化組分和蛋白純度，結果如表4所示。可以看出，5#基礎培養基條件下的VEGF-MA質量較高。綜合目的產物產量及質量，選用5#培養基，即ActiCHO P Powder CD，作為后續研究中所用的基礎培養基。

2.1.2補料培養基優化

選取如表2所示的10種補料培養基，在使用ActiCHO P Powder CD基礎培養基的條件下，按照1.3.2小節所述的方法進行補料操作，以篩選最優的補料培養基。培養14 d后，細胞培養液中的VEGF-MA產量和質量分別如圖2和表5所示。綜合考慮VEGF-MA的產量和質量，選取8#補料培養基，即CD Efficient Feed C AG，作為后續研究中使用的補料培養基。補加CD Efficient Feed C AG后，對目的產物質量影響不明顯，且VEGF-MA的產量達到2.55 g/L。

圖1 不同基礎培養基條件下的VEGF-MA產量

圖2 添加不同補料培養基條件下的VEGF-MA產量

表4 不同基礎培養基下的VEGF-MA質量

表5 添加不同補料培養條件基下的VEGF-MA質量

2.1.3外源添加物優化

選取如表3所示的7種外源添加物，考察在補加不同外源添加物條件下VEGF-MA的生產性能。在使用ActiCHO P Powder CD基礎培養基和CD Efficient Feed C AG補料培養基的條件下，培養14 d后，細胞培養液中的VEGF-MA產量和質量分別如圖3和表6所示。從中可以看出，添加各種外源添加物條件下，VEGF-MA產量均有不同程度的提高。綜合考慮VEGF-MA的產量和質量，選取1#外源添加物，即Sheff-CHO Plus PF ACF。添加該物質后，對目的產物質量影響不明顯，且VEGF-MA產量由2.54 g/L提高至3.20 g/L。

表6 補加不同外源添加物條件下的VEGF-MA質量

圖3 補加不同外源添加物條件下的VEGF-MA產量

2.2 3 L發酵罐培養條件優化

2.2.1接種密度優化

將上述研究中所獲得的培養基組合用于3 L發酵罐中培養CHO細胞生產VEGF-MA的過程，即使用ActiCHO P Powder CD基礎培養基CD Efficient Feed C AG補料培養基，并添加Sheff-CHO Plus PF ACF。共進行三個批次的發酵實驗，培養14 d后VEGF-MA產量均在3.20 g/L左右(圖4)，且VEGF-MA電荷異質性、糖基化水平和蛋白純度均達到質量標準(表7)。在后續的研究中，將以這三個批次作為對照，在3 L發酵罐中對接種密度、pH、溶解氧濃度(DO)、前期培養溫度和后期培養溫度做進一步優化。

圖4 最優培養基配比條件下的VEGF-MA產量

表7 最優培養基配比條件下的VEGF-MA質量

首先優化接種密度，分別考察0.7×106個/mL、1.0×106個/mL和1.3×106個/mL三個接種密度條件下的VEGF-MA生產性能，VEGF-MA產量和質量和分別如圖5和表8所示。可以看出接種密度對VEGF-MA產量、電荷 異質性、糖基化水平和VEGF-MA純度均沒有顯著影響。因此，在后續研究中，仍然使用1.0×106個/mL的接種密度。

圖5 不同接種密度條件下的VEGF-MA產量

表8 不同接種密度條件下的VEGF-MA質量

2.2.2pH優化

對細胞培養過程中的pH進行優化，分別考察pH設定為7.00(對照)、7.10和7.15條件下的VEGF-MA生產性能，VEGF-MA產量和質量和分別如圖6和表9所示。pH設定為7.10時VEGF-MA產量最高，達到表達量3.70 g/L。此時的電荷異質性、糖基化水平和VEGF-MA均處在標準的范圍內。因此，在后續的研究中都將選用7.10作為pH的設定值。

圖6 不同pH條件下的VEGF-MA產量

表9 不同pH條件下的VEGF-MA質量

2.2.3DO優化

對細胞培養過程中的DO進行優化，分別考察DO為20%(對照)、40%和80%條件下的VEGF-MA生產性能，VEGF-MA產量和質量和分別如圖7和表10所示。從中可以看出，DO對VEGF-MA產量、蛋白異質性和糖基化水平并無顯著影響，但DO為40%時VEGF-MA純度最高。因此，在后續的研究中，均使用40%的DO水平。

圖7 不同DO條件下的VEGF-MA產量

表10 不同DO條件下的VEGF-MA質量

2.2.4前期培養溫度優化

在培養CHO細胞表達目的蛋白的過程中，培養前期通常采用較高的溫度，而在培養后期適當降溫，本研究首先對培養前期的溫度進行優化。考察培養前期溫度分別為36.0 ℃(對照)、36.5 ℃和37.0 ℃條件下VEGF-MA的生產性能，結果如圖8和表11所示。36.5 ℃條件下，VEGF-MA濃度和純度分別為3.26 g/L和96.6%，均高于其他兩個批次。因此，在后續的研究中將繼續采用36.5 ℃的前期培養溫度。

圖8 不同前期培養溫度條件下的VEGF-MA產量

表11 不同前期培養溫度條件下的VEGF-MA質量

2.2.5后期培養溫度優化

對培養后期的溫度進行優化。考察培養后期溫度分別為32.0 ℃、33.0 ℃(對照)和34.0 ℃條件下VEGF-MA的生產性能，結果如圖9和表12所示。后期培養溫度為34.0 ℃時能夠獲得最高的VEGF-MA產量(4.10 g/L)，而此時的VEGF-MA質量也能達到標準。因此可以確定，最佳的后期培養溫度為34.0 ℃。

圖9 不同后期培養溫度條件下的VEGF-MA產量

表12 不同后期培養溫度條件下的VEGF-MA質量

3 結論

(1) 培養重組CHO細胞生產VEGF-MA的最優基礎培養基、補料培養基和外源添加物分別為ActiCHO P Powder CD、CD Efficient Feed C AG和Sheff-CHO Plus PF ACF。在此條件下的VEGF-MA的產量為3.20 g/L。

(2) 3 L發酵罐下的最優培養條件：接種密度為1.0×106個/mL、pH為 7.10、溶解氧濃度為40%、前期培養溫度為36.5 ℃、后期培養溫度為34 ℃。在此條件下VEGF-MA的產量能夠達到4.10 g/L的較高水平，且VEGF-MA質量較高。