miR-424對肝癌細胞增殖、細胞周期和侵襲活性的影響

呂 薇，龍 波，魏秀麗

我國是肝癌的高發國家，但是肝癌的致病機制目前仍不清楚，給其防治帶來障礙，探討肝癌的發生、發展以及轉移機制一直是學者們關注的熱點問題[1]。微小RNA(microRNA， miRNA)是一種長約22 nt的非編碼性小片段RNA。近年來研究顯示，miRNA可以參與基因轉錄后的調控，調節靶蛋白的表達，可以參與到腫瘤的致病過程中[2]。miR-424是miR-16家族成員，miR-16家族對細胞周期和表型都具有調控作用，臨床研究發現，miR-424在結直腸癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌等一些實體腫瘤中低表達，并且在肝癌患者中miR-424也呈現低表達狀態，與患者的預后密切相關[3]。本研究從細胞水平探討miR-424對肝癌細胞增殖、細胞周期和侵襲活性的影響，以期探明miRNA-424在肝癌中的作用，為其臨床防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 肝癌HepG2細胞購自中國典型培養物保藏中心，RMPI-1640培養基、胎牛血清購自美國GIBCO公司，青霉素和鏈霉素、結晶紫、碘化丙啶(PI)、胰酶購自美國Sigma公司，Trizol、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。miR-424表達質粒以及空質粒載體購自上海吉瑪基因有限公司，miR-424和內參U引物由上海吉瑪基因有限公司設計與合成，Transwell小室購于美國Corning公司。Step One Plus實時熒光定量PCR儀和酶標儀為美國Bio-rad公司產品，流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產品。

1.2細胞培養 肝癌HepG2細胞在5% CO2、37℃條件下，培養于RMPI-1640培養基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)，達到80%融合時胰酶消化傳代。

1.3miR-424基因轉染和鑒定 實驗分為3組，空白對照組不做轉染處理，陰性對照組轉染空質粒載體，miR-424表達組轉染miR-424表達質粒，取對數生長期HepG2細胞，1×105個/孔接種到6孔板，細胞貼壁后換無胎牛血清培養基，質粒轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，轉染2 h后換含胎牛血清培養基，繼續培養24 h后使用熒光定量PCR法進行轉染結果鑒定，胰酶消化細胞離心后加入1 ml Trizol，按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒說明書操作檢測miR-424表達情況，PCR擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，30個循環；72℃ 10 min。對照內參用2-ΔΔCt表示miR-424的相對表達水平。

1.4細胞增殖能力檢測 使用平板克隆形成實驗檢測HepG2細胞增殖能力，取上述3組對數生長期HepG2細胞，1×104個/孔接種到培養皿，72 h后70%乙醇固定后加入0.5%結晶紫染色30 min，PBS洗滌后計算克隆形成率=克隆數/1×104×100%。

1.5細胞周期檢測 使用流式細胞儀檢測HepG2細胞周期的變化，取上述3組對數生長期HepG2細胞，1×105個/孔接種到6孔板，培養48 h后，胰酶消化收集細胞，4℃條件下無水乙醇固定過夜，加入10 μg/ml PI染色30 min后，上流式細胞儀檢測，使用貝克曼庫爾特公司研發的CXP流式分析軟件分析細胞周期。

1.6細胞侵襲活性檢測 使用Transwell實驗檢測HepG2細胞侵襲活性，取上述3組對數生長期HepG2細胞，1×105個/孔接種到Transwell小室，培養48 h后，4%甲醛固定后0.5%結晶紫染色30 min，顯微鏡計數每高倍鏡視野(200×)下穿過Transwell小室的細胞數，計算5個視野取平均值。

2 結果

2.1miR-424轉染效果分析 空白對照組、陰性對照組和miR-424表達組miR-424的2-ΔΔCt值分別為0.24±0.05、0.23±0.04和0.62±0.15，miR-424表達組2-ΔΔCt值顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照和陰性對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2miR-424表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響 空白對照組、陰性對照組和miR-424表達組克隆形成率分別為(37.42±6.12)%、(36.83±6.14)%和(12.26±2.04)%，miR-424表達組克隆形成率顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 肝癌HepG2細胞增殖的平板克隆形成實驗

2.3miR-424表達對肝癌HepG2細胞周期的影響 miR-424表達組HepG2細胞增殖主要停滯在G1期，G1期細胞比例顯著高于空白對照組和陰性對照組，S期和G2期細胞比例顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組間G1、S和G2期細胞比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2和表1。

圖2 3組肝癌HepG2細胞周期的流式細胞儀檢測結果

表1 3組肝癌HepG2細胞周期分布

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，cP<0.05

2.4miR-424表達對肝癌HepG2細胞侵襲能力的影響 空白對照組、陰性對照組和miR-424表達組穿過Transwell小室細胞數分別為284.35±37.46、272.83±37.33和82.46±20.13，miR-424表達組穿過Transwell小室細胞數低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 3組肝癌HepG2細胞侵襲實驗結果(結晶紫染色×200)

3 討論

原發性肝癌是全球男性癌癥死亡的主要原因之一，其發病機制復雜，目前仍未闡明。近年來，miRNA在肝癌中的作用受到學者們的關注，并有作為分子標記物或治療靶點的趨勢[4]。miR-424在細胞周期、增殖、凋亡及存活等過程中有重要作用，劉明輝等[5]研究顯示，在胃癌SGC-7901細胞中過表達miR-424，可以上調自噬相關蛋白Beclin1，誘導細胞自噬發生，抑制細胞增殖活力。Li等[6]研究顯示，抑制miR-424后，可以顯著促進卵巢癌的增殖和遷移能力。林琳等[7]發現miR-424可以通過上調Rspo3基因，促進人結腸癌Lovo細胞增殖。Wang等[8]研究顯示，長鏈RNA LINC00511可以通過下調miR-424促進肝癌細胞的增殖，且與患者的預后密切相關。本研究結果顯示，肝癌HepG2細胞轉染miR-424，腫瘤細胞克隆形成能力得到了抑制，細胞的增殖主要阻滯在G1期，提示miR-424在肝癌中發揮抑癌作用。Shekhar等[9]報道，miR-424通過下調細胞周期素A2表達抑制骨肉瘤細胞周期增殖。

侵襲能力決定患者預后。Wu等[10]報道，miR-424在膽管癌細胞遷移和間變中發揮重要作用。本研究結果顯示，肝癌HepG2細胞轉染miR-424后，穿過Transwell小室細胞數低于空白對照組，提示升高miR-424后腫瘤細胞侵襲遷移能力得到抑制。

綜上所述，過表達miR-424可抑制肝癌HepG2細胞增殖和侵襲能力，有望成為肝癌防治分子靶點。