人源性肝母細胞瘤異種移植模型的構建＊

張守華，雷俊，項燈，萬夢琪，鄧慶強，何遠橋，陳夢潔，曾俊權

（1.江西省兒童醫院普外科，南昌330006；2.南昌大學動物科學部，南昌330006；3.井岡山大學醫學部，吉安343009）

肝母細胞瘤（hepatoblastoma，HB）是兒童期最常見肝臟惡性腫瘤，但其發病率僅為1.2/1000000-1.5/1000000，臨床少見[1]。由于缺乏能可靠的臨床前研究模型，該病的發病機制、治療方法的研究進展緩慢。人源性腫瘤異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型是通過手術或活檢獲取腫瘤標本直接移植到免疫缺陷小鼠建立的個體化腫瘤模型，代替人體實施化療藥物敏感性實驗。PDX模型實現了患者腫瘤組織在免疫缺陷鼠體內成瘤，保留了患者的分子表型和基因型，可以很好地預測后期臨床結果[2]。肝母細胞瘤的PDX模型此前未見報道。本研究將為肝母細胞瘤患者制訂個體治療方案的研究奠定基礎，同時可以更準確地預測新型藥物的臨床前療效和藥物毒性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 肝母細胞瘤患兒3例，其中男1例，女2例；平均年齡為1.2歲；術后均病理證實為肝母細胞瘤。該研究得到江西省兒童醫院倫理委員會的批準。患者監護人簽署知情同意書。

1.2 原代腫瘤細胞的獲取 取部分手術切除后的肝母細胞瘤腫瘤，去除壞死、出血組織，取部分存儲在液態氮中的胎牛血清+10%二甲基亞砜（DMSO;Sigma）中（緩慢冷卻），以備以后植入小鼠中使用。1.3 PDX模型的建立 新鮮的腫瘤組織塊用碘伏（利爾康）消毒，臺盼藍染色，最后在含有1%青霉素/鏈霉素的培養基中沖洗。在獲得樣本4h內，除去染色的組織，然后切成約3×3×3 mm3的小塊。使用乙醚進行鎮靜裸鼠，皮下接種腫瘤組織到肩胛骨前區和后肢的背面。6-8周齡雌性BALB/c裸鼠購于湖南史萊克有限公司，實驗前飼養至少3 d且12h的晝夜周期。根據南昌大學實驗室動物護理原則進行動物保護。

用游標卡尺至少每周兩次監測異種移植物的生長，測量腫瘤的長度（a）和寬度（b）。當腫瘤的體積達到約800-1500mm3時，收集腫瘤組織并處死小鼠：將部分組織重復上述操作，以建立穩定的PDX模型；或剪碎至10mm3，加入凍存液(10%DMSO+90%FBS)凍存于液氮罐；其余部分用福爾馬林固定以制備HE染色切片。腫瘤傳代了幾代，進一步用Px（x=代數）表示，P0代表第一代腫瘤組織。

2 結果

2.1 患者腫瘤組織標本 患者腫瘤組織標本中的腫瘤細胞異型性明顯，存在病理性核分裂，形態符合肝母細胞瘤(圖A，B)。

2.2 PDX模型的建立 3例患兒腫瘤組織接種至裸鼠皮下，僅有一例構建成功，其PDX成瘤率約為33%。小鼠腫瘤組織有明顯的包膜，細胞與患者腫瘤組織細胞形態基本相似(圖C，D)，呈異型性，核質比較大，存在核分裂像。

圖A-B：人體腫瘤組織HE染色；圖C-D：PDX腫瘤組織HE染色兩者均可見相似的腫瘤細胞：細胞較小，圓形或卵圓形，排列不規則，似胚胎肝組織

3 討論

肝母細胞瘤是小兒時期的惡性腫瘤，主要發生于3歲以下兒童，且男孩多于女孩[1,3]。HB最常見遠處轉移的部位是肺部，大約有10%患者確診時就有肺部轉移，一般不發生骨轉移，但可發生腦轉移[1,4]。目前對于兒童HB主張早期明確診斷及準確分期，采用以手術治療、化學藥物治療和必要時放射治療的多學科聯合診治策略[5]。

PDX模型采用一個模型對應一個患者的模式，保留了腫瘤組織的遺傳特征，組織學特征以及腫瘤微環境，更直觀地反映個體間腫瘤的差異性；同時與傳統的細胞核動物模型相比，能更好地反映臨床患者的實際病情變化，而且藥篩結果與臨床結果具有較高的匹配度[6]。PDX模型是將腫瘤患者離體新鮮組織移植到免疫缺陷小鼠體內，可分為異位移植和同位移植。原位移植是將腫瘤組織種植至患者原發病灶組織，更精準模擬腫瘤微環境。由于有些腫瘤難以進行原位移植，可通過異位移植，例如皮下移植方式，其具有操作簡單、成瘤率高、腫瘤生長特點易觀察等特點。

影響PDX模型成功率的因素較多，例如移植部位、小鼠品系以及原發腫瘤特征等。本實驗采用患者肝母細胞瘤組織BALB/c裸鼠腫瘤異位移植方法，建立患者來源的肝母細胞瘤PDX模型，其成瘤率為33%，小鼠腫瘤組織有明顯的包膜，細胞與患者腫瘤組織細胞形態基本相似。國內尚未見有關于肝母細胞瘤PDX模型建立的文獻報道，Beatrice等[7]通過同位移植方式成功建立3例肝母細胞瘤PDX模型（成功率為25%），其成功率可能是由于所有患者均進行化療，導致組織壞死以及AFP降低，阻礙PDX模型的成功建立。盡管PDX模型可以更好地模擬腫瘤微環境，而且其疾病進展、腫瘤轉移以及藥物敏感性均表現出與臨床病例具有較強的相似性。本研究也證實肝母細胞瘤PDX模型的病理特點與臨床病理結果一致。但是，由于PDX模型小鼠價格昂貴、模型建立周期長以及模型成功率較低等因素，限制了PDX的大規模使用。

本研究彌補了現有肝母細胞瘤臨床前模型的部分不足，為進一步腫瘤藥物篩以及精準治療選提供了良好的動物模型。