金剛藤對人肝癌SMMC-7721細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

文一惠，凌江紅，，叢軍，李莉

1廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021；2上海中醫藥大學附屬曙光醫院

原發性肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤。原發性肝癌中最為常見的是肝細胞肝癌(HCC)，占80%～90%[1]。目前，HCC的治療主要有外科手術、消融治療、介入治療、化療、靶向治療、免疫治療、中醫藥治療等。在HCC發病早期，首要治療手段是肝臟切除，但大部分HCC臨床確診時已達中晚期，僅有20%的HCC患者有機會接受手術治療，術后仍有腫瘤復發、轉移等不利因素[2，3]。消融治療、介入治療是基于腫瘤定位及較小腫瘤有效的治療手段。大部分傳統化療藥不良反應較多，易產生耐藥[4，5]。而靶向治療及免疫治療存在個體差異，且費用高昂。因此，尋找療效穩定且不良反應小的治療藥物有重要意義。金剛藤為百合科菝葜屬植物的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀的功效，臨床上常用于治療風濕關節痛、跌打損傷、盆腔炎等疾病。本課題組前期研究發現金剛藤具有良好的抗腫瘤作用[6]。2019年1～8月，本研究觀察了不同濃度金剛藤對人肝癌SMMC-7721細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，進一步探討金剛藤的抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞及主要材料 SPF級SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證編號為SCXK(滬)2018-0004，雌雄不限，鼠齡8～10周，共16只。大鼠適應性喂養7 d后用于實驗，喂養期間大鼠自由進食、水。人肝癌SMMC-7721細胞株由上海中科院細胞庫提供。將SMMC-7721細胞按1×106/板接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2、恒溫恒濕條件的細胞培養箱中培養，1～2 d換液傳代1次。待細胞進入對數生長期后進行實驗。中藥金剛藤購自廣西民族醫藥研究所，產地廣西，批號為161201，由桂林鼎康中藥飲片有限公司生產。DMEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗混合液、胎牛血清購自美國GIBCO公司。Apoptosis Detection Kit購自上海翊圣生物科技有限公司。CO2培養箱購自美國Thermo公司。多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司。流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 金剛藤水煎液及含藥血清的制備 ①金剛藤水煎液的制備：200 g金剛藤飲片，加水至高出藥物表面2～3 cm處，浸泡2 h武火煮沸后改用文火煎煮30 min，冷卻，過濾取汁(濾液1)，濾渣如上法再煎2次，得到濾液2、濾液3，混合3次得到的藥液，濃縮至100 mL，得到2 g/mL的藥液，4 ℃保存備用。②含藥血清的制備：SPF級SD大鼠16只，隨機分為空白組(Control組)、金剛藤低劑量組(JGT-L組)、金剛藤中劑量組(JGT-M組)和金剛藤高劑量組(JGT-H組)，每組4只；JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組大鼠分別以0.5、1、2 g/mL的金剛藤水煎液灌胃、每次4 mL，Control組給予等體積生理鹽水灌胃，每天灌胃2次、間隔12 h，連續給藥3 d；末次給藥1 h后以CO2窒息法處死小鼠，心臟取血，靜置后離心15 min取血清，合并同組血清，過濾、滅活除菌后得到含藥血清，-80 ℃凍存備用。

1.3 細胞分組及給藥方法 取對數生長期SMMC-7721細胞分為Control組、JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組，用DMEM培養液調整細胞濃度為1×105/mL，加入96孔培養板、每孔0.1 mL，在37 ℃、5% CO2培養箱中過夜，待細胞貼壁達到70%～80%時，棄去細胞培養液。JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組、Control組分別加入0.5、1、2 g/mL的含藥血清4 mL和等量生理鹽水。

1.4 細胞增殖能力觀察 分別于培養12、24、48 h后行CCK-8實驗。每組重復6個副孔，每孔分別加入10 μL的CCK-8，繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育3 h。用酶標儀測定450 nm波長處各孔的光密度值(OD值)，表示細胞增殖能力。

1.5 細胞凋亡率測算 培養24 h后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，去除培養基。用PBS清洗1次后，空白血清組重懸于1×Binding Buffer(400 μL)，金剛藤含藥血清組重懸于1×Binding Buffer(100 μL)中。取出100 μL上述溶液至流式管中，分別加5 μL的FITC-Annexin Ⅴ和5 μL的Propidum Iodide。輕柔彈起混勻，室溫(25 ℃)避光孵育15 min。向每管中加入400 μL的1×Binding Buffer，混勻。1 h內上流式細胞儀檢測，并計算細胞凋亡率。

1.6 細胞周期檢測 培養24 h后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，去上清。用PBS洗2次，邊振蕩邊加-20 ℃預冷的70%乙醇1 mL，4 ℃固定30 min或-20 ℃固定過夜，直至進行DNA染色。染色時取出標本，于1 000 r/min離心5 min，將乙醇吸除，加PBS清洗固定液1～2次后，1 000 r/min離心5 min，棄上清。吸除離心管內PBS，加入200 μL的PBS和2 μL的RNA酶(0.25 mg/mL)，37 ℃孵育30 min，加入PI(50 μg/mL)5 μL室溫(25 ℃)避光反應30 min。用流式細胞儀檢測并分析細胞周期。

2 結果

2.1 金剛藤對SMMC-7721細胞增殖的影響 各金剛藤藥物組相同作用時間下細胞增殖能力均低于Control組(P均<0.05)；JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組細胞增殖能力逐漸減弱，組間兩兩相比，P均<0.05。見表1。

表1 各組SMMC-7721細胞增殖能力比較

注：與同時點Control組比較，*P<0.05；與同時點JGT-L組比較，#P<0.05；與同時點JGT-M組比較，△P<0.05。

2.2 金剛藤對SMMC-7721細胞凋亡的影響 Control組、JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組細胞凋亡率分別為5.48%±0.13%、6.86%±0.69%、8.75%±0.22%、9.80%±0.35%。各金剛藤藥物組細胞凋亡率均高于Control組(P均<0.05)；JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組細胞凋亡率逐漸升高，兩兩相比，P均<0.05。

2.3 金剛藤對SMMC-7721細胞周期的影響 JGT-M組、JGT-H組G0/G1期細胞比例高于Control組(P均<0.05)；JGT-L組S期細胞比例高于Control組，JGT-M組、JGT-H組S期細胞比例低于JGT-L組，JGT-H組S期細胞比例低于Control組(P均<0.05)；JGT-L組、JGT-M組G2/M期細胞比例低于Control組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組SMMC7721細胞周期分布比較

注：與Control組比較，*P<0.05；與JGT-L組比較，#P<0.05。

3 討論

金剛藤味微辛，性溫，歸肝腎經，可以利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀，治療風濕關節痛、跌打損傷、盆腔炎等。近年來發現，金剛藤對腫瘤具有很好的抑制作用，在臨床上取得了一定療效。王靜等[7]發現，復方菝葜顆粒聯合髂內動脈栓塞灌注化療治療局部晚期宮頸癌療效較好，可有效減少不良反應，增強患者免疫功能。有學者[8，9]發現復方菝葜顆粒治療中晚期非小細胞肺癌有一定療效，有望延長肺癌患者的生存期，提高生活質量。另外，還有多項基礎研究證實了金剛藤的抗腫瘤作用。Nambiar等[10]發現，金剛藤的成分水飛薊賓能使腫瘤細胞發生G1期阻滯、誘導細胞凋亡，從而發揮抗胰腺癌活性。Fu等[11]研究表明，金剛藤可通過線粒體途徑誘導人肺腺癌A549細胞凋亡。Yu等[12]發現金剛藤的甲醇提取物能夠通過ERK途徑誘導人口腔癌MC-3細胞凋亡。本課題組前期檢測10種壯藥含藥血清對SMMC-7721細胞生長的抑制情況，觀察到金剛藤、藤梨根、葉下珠、半枝蓮可抑制肝癌細胞增殖，其中金剛藤對SMMC-7721細胞抑制作用最強[6]。所以,本實驗以SMMC-7721細胞為研究對象，觀察金剛藤對其增殖、凋亡及細胞周期的影響。

一系列基因精密調控著細胞的增殖，失去基因的正常調控后，細胞可無限增殖，導致腫瘤的發病[13]。抑制腫瘤細胞增殖，能夠延緩腫瘤的發展和轉移。吳先闖等[14]采用MTT法檢測菝葜提取分離的乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對肝癌細胞H22、HepG-2、BEL-7402體外生長抑制情況，結果顯示4種提取部位均有不同程度的抗肝癌細胞活性，其中乙酸乙酯部位抑制細胞增殖活性最強，呈現劑量依賴性。本研究結果顯示，金剛藤對SMMC-7721細胞增殖有明顯的抑制作用，隨著金剛藤濃度增加，其抑制效果更顯著，與相關研究結果一致。

細胞凋亡是細胞在一系列內源性基因的調控下發生的自然或生理性死亡的過程，是機體維持生理活動所必需的。細胞凋亡障礙會誘導腫瘤的發生發展[15]。Hu等[16]研究表明，金剛藤可通過激活Caspase-3、PARP和Bax誘導細胞凋亡，抑制NF-κB的核轉錄，下調Bcl-2、Bcl-XL、cIAP-1、XIAP和AKT表達，誘導卵巢癌A2780細胞凋亡。廖子君等[17]發現菝葜皂苷能夠上調胃癌BGC-823細胞Bax蛋白水平、下調Bcl-2蛋白水平，從而誘導其凋亡。何萍等[18]研究顯示，菝葜、紅藤、藤梨根三藥聯合使用可增強對人胃癌SGC-7901細胞的抗癌作用，可能與活化Caspase-3有關。本研究結果顯示，金剛藤對SMMC-7721細胞具有凋亡誘導作用，隨著金剛藤濃度增加，SMMC-7721細胞凋亡率逐漸增高，證實了金剛藤可誘導肝癌細胞凋亡。

腫瘤的發生發展不僅與細胞增殖、細胞凋亡有關，也與細胞周期關系密切。細胞周期的調控在腫瘤發生發展過程中同樣起著關鍵作用。細胞周期調控紊亂將導致細胞惡性轉化和腫瘤細胞失控性增殖[19]。于麗秀等[20]觀察了菝葜對乳腺癌A2780、HO8910PM細胞存活的影響，發現菝葜的對兩種卵巢癌細胞均有抑制作用，抑制作用呈劑量及時間依賴性。有研究發現金剛藤的成分水飛薊賓能使胰腺癌細胞阻滯于G1期[10]。本研究采用流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示，金剛藤對SMMC-7721細胞周期具有阻滯作用，其中JGT-M組、JGT-H組主要將細胞阻滯在G1期，提示金剛藤可調控肝癌細胞周期，這與相關研究[10]結果一致。

綜上所述，金剛藤可抑制SMMC-7721細胞增殖、誘導細胞凋亡，并將細胞周期阻滯于G0/G1期，相關機制仍有待進一步深入研究。