載脂蛋白E在膿毒癥中抗炎作用的體內外實驗觀察

趙田，邵義明

1廣東醫科大學，廣東湛江524001；2廣東醫科大學附屬第二醫院；3湛江市器官功能損傷與保護轉化醫學重點實驗室

膿毒癥是機體對感染反應失調而導致的器官功能障礙[1]，病死率可達25%，合并休克的膿毒癥患者病死率超過80%[2，3]。有效遏制膿毒癥的發生發展有助于降低病死率。載脂蛋白E(ApoE)是乳糜蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)等血漿脂蛋白的主要結構成分，在這些脂蛋白的代謝中起著重要作用[4]。ApoE與許多炎癥有關疾病密切相關，如2型糖尿病[5]、心血管疾病[6]、阿爾茨海默病[7]等。目前對于ApoE與膿毒癥的文獻報道很少。2018年3月～2019年7月，本研究構建了細胞膿毒癥模型和動物膿毒癥模型，觀察ApoE對膿毒癥細胞及小鼠的抗炎作用，為膿毒癥的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞與其他材料 SPF級健康的野生型小鼠(WT，8～12周，雄性)和ApoE敲除小鼠(ApoE-/-，8～12周，雄性)各14只，體質量20～25 g。小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7在37 ℃恒溫培養箱生存，在添加10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中進行培養，每2 d傳代1次。LPS購自美國Sigma公司。ApoE購自美國Peprotech公司。

1.2 ApoE對膿毒癥的體外抗炎作用觀察

1.2.1 細胞分組與模型制作 將RAW264.7細胞分為對照組、ApoE組、LPS組、LPS+ApoE組。對照組不做特殊處理。ApoE組加入5 μg/mL的ApoE。LPS組加入1 μg/mL的LPS。LPS+ApoE組先加入1 μg/mL的LPS，6 h后加入5 μg/mL的ApoE。

1.2.2 培養液上清炎癥因子檢測 各組處理24 h后吸取細胞培養液上清，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β。所有檢測均需重復3次，取平均值。

1.3 ApoE對膿毒癥的體內抗炎作用觀察

1.3.1 小鼠分組與模型制作 將WT小鼠分為WT組、WT+LPS組，將ApoE-/-小鼠分為ApoE-/-組、ApoE-/-+LPS組，每組各7只。WT組、ApoE-/-組不做特殊處理。WT+LPS組、ApoE-/-+LPS組采用腹腔注射10 mg/kg LPS制作膿毒癥模型。

1.3.2 血清炎癥因子檢測 造模后1 h通過眼球取靜脈血，3 000 r/min離心10 min，獲取血清，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β。

1.3.3 生存情況觀察 造模后72 h觀察各組小鼠生存情況。

2 結果

2.1 各組細胞培養液上清炎癥因子水平比較 見表1。

表1 各組細胞培養液上清炎癥因子水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與LPS組相比，#P<0.05。

2.2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 見表2。

表2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

注：與WT組相比，*P<0.01；與ApoE-/-組相比，#P<0.01；與WT+LPS組相比，△P<0.05。

2.3 各組小鼠生存情況比較 ApoE-/-+LPS組小鼠造模后24 h內全部死亡，WT+LPS組小鼠造模后72 h仍有2只存活(Log-Rank=0.002，P=0.96)。

3 討論

膿毒癥是細菌入血后，短時間內釋放大量LPS導致機體產生大量炎癥介質，這些炎癥介質直接作用于機體，使機體產生炎癥反應，炎癥反應過于強烈會導致嚴重的心血管系統、腎臟、肝臟等多種器官功能障礙，嚴重者可導致死亡[8，9]。對膿毒癥患者早期實行干預能進一步阻斷病情發展，改善患者預后。近年研究表明，ApoE不僅能結合和運輸血脂到機體各組織進行代謝[10]，還具有抗炎活性和免疫調節功能。ApoE可調節巨噬細胞吞噬功能，抑制T細胞增殖[11]，促進CD1分子向自然殺傷T(NKT)細胞呈遞脂質抗原，同時在細胞水平上提出了ApoE介導的NKT細胞活化模型，可以促使NKT細胞活化[12，13]。

為進一步了解ApoE與膿毒癥的關系，我們分別在RAW264.7細胞和小鼠水平上進行膿毒癥造模，觀察ApoE對炎癥因子表達的影響，同時觀察注射ApoE后小鼠72 h生存狀態。本研究結果顯示，LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于對照組，LPS+ApoE組IL-6水平低于LPS組，提示ApoE可以抑制炎癥因子表達。也有體外培養實驗發現，LPS可通過激活Toll樣受體，促進巨噬細胞分泌炎癥因子，炎癥因子又可以通過激活細胞內MAPK和PI3K/AKT等信號通路抑制ApoE的合成[14]。動物水平實驗結果顯示，WT+LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于WT組;ApoE-/-+LPS組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于ApoE-/-組；ApoE-/-+LPS組血清IL-6水平高于WT+LPS組；ApoE-/-+LPS組小鼠造模后24 h內全部死亡，WT+LPS組小鼠造模后72 h仍有2只存活。這進一步表明ApoE在膿毒癥中起到了抗炎作用。先前研究表明，與野生型小鼠相比，ApoE敲除小鼠血清TNF-α表達水平升高，并且對內毒素和念珠菌感染敏感性增加[15]，小鼠死亡率增加，與我們的實驗結果一致。上述研究結果都表明ApoE在膿毒癥中發揮抗炎作用。

研究表明，ApoE還可通過增加單核細胞和巨噬細胞中miRNA-146a表達，抑制NB-κB介導的炎癥和動脈粥樣硬化[16]。我們推測ApoE在膿毒癥中的抗炎作用可能也與增加單核細胞、巨噬細胞miRNA-146a水平、抑制NB-κB介導的炎癥反應有關。同時，ApoE是一個多態性蛋白，有3種亞型，即ApoE2、ApoE3和ApoE4[17]。在神經相關性疾病中，ApoE3主要發揮保護作用[18]，ApoE4則是危險因子[19，20]。推測ApoE發揮保護作用可能與ApoE3的功能有關，具體機制有待進一步研究。