控制氮肥施用引起的活性氮氣體排放：脲酶/硝化抑制劑研究進展與展望

馬 芬，楊榮全，郭李萍

（農業農村部農業環境重點實驗室，中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，北京100081）

農業生產中因氮肥不合理施用向大氣中排放的活性氮氣體主要包括NH3、N2O 和氮氧化物（NO、NO2）。NH3作為堿性氣體，能與大氣中的NO2或SO2等酸性氣體以及揮發性有機物發生反應而生成銨鹽氣溶膠，是空氣霧霾形成的主要途徑，對空氣質量及人體健康造成負面影響[1]；此外，揮發到大氣中的NH3還能以干沉降形式再回到地面，對自然生態系統產生影響[2]。好氣條件下土壤中氮素的硝化過程會產生N2O 和NO，嫌氣條件下土壤中氮素的反硝化過程也會產生N2O及氮氧化物（NO、NO2）。其中，N2O的溫室效應是等質量CO2氣體的265 倍[3]，是主要的農業源溫室氣體之一；土壤中產生的NO 氣體，進入到大氣中會被氧氣或臭氧等氧化劑氧化為NO2，進而與水反應形成硝酸型酸雨降落到地面[4]。化肥對全球及中國糧食增產的貢獻分別為50%～60%和21%[5-6]，我國農業生產中氮肥用量占到化肥總用量的40%，其中速效性氮肥占95%以上[7]。由于農民盲目追求產量及認知不足導致的不合理施肥所產生的活性氮排放給環境造成了各種負面影響，在一些經濟發達地區尤為嚴重[8]。因此，提高氮肥肥效，降低活性氮對氣候及環境的負面影響在全球范圍內被廣泛關注[4]，目前，較為有效及成本適中的首選方法是合理控制氮肥用量及采用氮肥增效劑[9]。

氮肥增效劑主要包括脲酶抑制劑（UI）和硝化抑制劑（NI）兩類，都與氮肥配合施用，以減少氮素損失、提高氮肥肥效。土壤中的銨態氮能被黏土礦物晶格所固定，也能被帶負電的土壤膠體吸附而暫時保存起來；而硝態氮由于帶負電，無法被帶負電的土壤膠體吸附，很容易隨降水或灌溉發生淋失而使氮素利用率降低[10-11]。UI 主要配合尿素施用，抑制尿素水解為銨的過程，使尿素盡可能以酰銨態氮保持于土壤中，減少氨揮發和其后一系列氮素轉化引起的可能損失及對氣候和環境的負面影響[12]。NI 是一類抑制氮素硝化作用過程的物質，硝化過程中銨態氮經羥胺及亞硝態氮轉化為硝態氮，期間會排放N2O和NO，NI能不同程度地延長銨態氮在土壤中的存留時間，避免硝化作用向大氣中排放N2O 和NO，同時也減少隨后因硝態氮淋洗或徑流對地下水和陸面水體造成污染，及因反硝化作用繼續排放N2O 和其他氮氧化物，直接或間接降低氮肥施用對氣候和環境的多方面風險[11，13]。抑制劑用量一般只占到氮肥用量的0.5%～5%（由于施用方法及土壤、作物類型等不同，也有少數研究報道NI 用量為氮肥用量的10%效果較好），價格比一般的緩釋肥有優勢，是一項有發展潛力的氮肥增效劑[9]。

本文對抑制劑的類型及新型抑制劑的發展、抑制劑作用機理及其對相關氮轉化微生物的影響、抑制劑控制活性氮氣體排放的效果及其影響因素進行綜述，為提高氮肥利用率及降低氮肥施用中活性氮氣體排放對氣候及環境的負面影響提供科學參考。

1 肥料氮素在土壤中轉化的主要過程及相關的微生物酶

速效性氮肥主要包括酰胺態氮肥（如尿素）、銨態氮肥（如硫銨）、硝態氮肥（硝酸鈣）、氨水、碳酸氫銨等，尿素是目前全球使用最為普遍的氮肥類型，特別是在發展中國家[7]。土壤中釋放活性氮氣體的過程主要包括尿素水解、硝化作用、反硝化作用等過程。

1.1 尿素水解過程與脲酶的作用

尿素施入土壤后，很快在脲酶的作用下水解為銨態氮。脲酶也稱酰胺水解酶，最適pH 為7.4，能夠專一性地催化尿素水解生成NH3和碳酸氫根，并短暫性地提高土壤環境的pH[14]（具體反應見方程1）。脲酶結晶首次是從刀豆粉中分離純化得到的，Sumner[15]因此獲得了1946 年諾貝爾化學獎。脲酶是一種含有鎳離子的酶[16]，在各種動植物、細菌和真菌中，特別是豆科植物中都廣泛存在，是一種金屬肽酶[17-18]。脲酶的分子量為480 000，有129 個半胱氨酰基、47 個巰基（半胱氨酰基殘基），其中有4～8個巰基對脲酶活性起重要作用[17]。細菌的尿素酶是由2～3 個不同亞基組成的雜聚肽，它包含γ、β 和α 3 個亞單位，分別由ureA、ureB 和ureC 基因編碼，組成尿素原酶，但還不具有活化活性；需要一些輔助基因（包括ureD、ureE、ureF、ureG、ureH、ureI 等）將鎳離子轉運到酶原才具有活性，活化后的脲酶含有3 個催化部位，每個部位都含有2 個鎳離子。脲酶被激活后，各種輔助因子從酶上解離下來持續進入下一個循環[19-20]。

1.2 硝化作用與硝化微生物

自養硝化作用是農業土壤中主要的硝化作用過程，該過程在硝化微生物的主導下完成，其中的第一步由具有氨單加氧酶（AMO）的氨氧化微生物參與，利用空氣中的氧氣將NH3先氧化為羥胺；之后由羥胺氧化還原酶（HAO）將羥胺繼續氧化為亞硝酸根；接著，在亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）的作用下繼續將亞硝酸根氧化為硝酸根，硝化作用會向土壤中釋放氫離子使土壤pH 短暫下降[21-22]（圖1）。其中，參與硝化作用第一步的氨氧化微生物包括氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）兩大類，分別為堿性土壤和酸性土壤中的主要氨氧化微生物[23-24]，該步驟是硝化作用的限速步驟。

圖1 氮素硝化作用示意圖Figure 1 Diagram of nitrogen nitrification

AOA 和AOB 的氨基酸序列相似度僅40%[25]，二者在細胞結構及代謝途徑方面還存在諸多差異（表1）。研究表明，AOA 為酸性土壤中的主要氨氧化微生物，有的AOA 菌株能在pH 為4 的環境下進行氨的氧化[26]。AOA 適應低pH 環境，可能與其基因組中含有大量脲酶編碼基因有關，使其能夠利用環境中的脲素作為氨氧化的基質[26]；此外，AOA 可能利用低pH下質子化的氨做基質，也是它在酸性環境中優勢明顯的原因之一[27]。農業土壤中氨氮濃度在人為施肥后都較高，因此即使是AOA 的數量級高于AOB，由于AOB的基質抑制濃度較高，其氨氧化反應的主導微生物仍是AOB。正是由于AOA 和AOB 的這些不同特征，各種UI及NI對硝化微生物和反硝化微生物的影響也不盡相同。AOB 會由于環境中氨的缺乏而無法生長，pH 每降低一個單位，非質子化的氨濃度會減少一個數量級，因此AOB 在酸性環境中因基質氨的缺乏而不能正常生長[23]。由于AOA 與AOB 的上述不同特征，使AOA 和AOB 存在明顯的生態位分異，AOA 主要在低氮及pH 較低的自然生態系統中占主導作用[27]。

AMO 除了能夠氧化氨以外，還可以氧化C-H 鍵和C=C 鍵。編碼AMO 的基因簇位于一個操縱子中，至少含有3 個基因（amoA、amoB 和amoC），一個細胞中一般含3個拷貝的AMO，且不同拷貝之間有很高的保守性[28-31]。HAO 是一種具有相同亞基的三聚體蛋白復合體，能夠氧化羥胺，長度為1710 bp，受氨基和亞硝酸的誘導表達[31]。NXR 是一種含有鐵、鉬、硫和銅離子的可溶性酶，基因簇中含有3 個基因（nxrA、nxrB 和nxrX），是由3 個不同亞基組成的三聚體膜結合蛋白，在染色體上相鄰排列并組成一個操縱子，3個基因的序列長度分別為3000、1539 bp 和648 bp；NXR 的催化作用是可逆的，受游離氨、亞硝酸及硝酸濃度、供氧狀況等的影響[32-33]。

此外，科學家們于2015 年發現了一種完全氨氧化細菌（Comammox Nitrosospira），能夠直接將氨氧化為硝酸根，而且這種完全氨氧化菌對氨具有較高的親和力，在貧營養環境中有競爭優勢[34-36]。這類完全氨氧化菌的AMO 在進化上與AOB 和AOA 的AMO 不同，傳統的16S rRNA 或nxrB 基因系統發育樹分析法無法區分它與傳統的硝化螺菌（Nitrospira），其AMO基因序列是穿插在嚴格的亞硝酸鹽氧化的硝化螺菌屬序列中，土壤中的完全氨氧化細菌基本屬于Nitrospira 譜系Ⅱ，對于亞硝酸鹽的親和力差[37-38]。在純培養條件下，完全氨氧化細菌在富集培養時能夠利用氨產生N2O，但土壤中該途徑的發生條件及能否產生N2O還仍然未知[39]。

表1 AOB與AOA在細胞結構及代謝途徑上的關鍵特征Table 1 The key characteristics of AOB and AOA in the cell structure and metabolic pathways

1.3 反硝化作用及其相關微生物

反硝化作用是硝態氮在微生物作用下脫氮的過程，完全反硝化作用過程有4個步驟（圖2），參與各步驟的微生物酶分別為硝酸還原酶（Nar）、亞硝酸還原酶（Nir）、NO 還原酶（Nor）及N2O 還原酶（Nos）[40]，其中關鍵的基因有nirS、nirK、nosZ。有的微生物具有完全反硝化作用的完整4 類酶，而有的微生物則只分泌其中部分步驟的酶，特別是反硝化作用中最后一個步驟的酶Nos，其豐度高低及類型（nosZ Ⅰ型或nosZ Ⅱ型）對反硝化作用過程的最終產物比（N2O/N2）起重要作用。研究發現，NI 對反硝化微生物功能基因的豐度也有一定影響[41]。

圖2 氮素反硝化作用示意圖Figure 2 Diagram of nitrogen denitrification

2 抑制劑的類型及作用機理

2.1 脲酶抑制劑

19 世紀40 年代，Conrad 發現某些物質可以抑制土壤脲酶活性并延長尿素的有效期。60 年代開始，發現含硼化合物、原子量大于50 的重金屬、含氟化合物、多元酚、多元醌和抗代謝物質類等對脲酶活性均有抑制作用，但由于各種UI 作用的發揮受到諸多條件的限制，使得不能投入實際生產應用中。70 年代，研究者們對百余種化合物進行了測試，Bremner[12]根據早期的研究篩選出抑制效果較好的苯醌類和氫醌類化合物，其中氫醌（HQ）因其較高的性價比在國際上得到了廣泛研究和應用。進入80 年代，國外開發了醌類、多羥酚類、磷酰胺類、五氯硝基苯等具有實用意義的UI。1996 年，美國IMC-Agrico 公司推出了活性成分為N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）的Agrotain 系列添加劑，可用于固體尿素和硝銨尿素液體肥料，其溶劑為含10%的N-甲基吡咯烷酮及無毒害的惰性緩沖溶液[42]。由于重金屬離子易造成環境污染，使其利用受到了一定限制，目前常用的UI為有機化合物類，主要為HQ、NBPT、苯基磷酰二胺（PPDA）、硫脲等。

從作用機理來看，UI 可大致分為3 大類，一類是尿素類似物（如硫脲、羥基尿素），作為尿素的競爭性抑制劑與脲酶作用；第二類是能與脲酶活性中心的巰基反應，使脲酶結構發生變化而失活的物質，如巰基類化合物、醌類、酚類化合物等；第三類化合物能與脲酶活性中心的鎳離子配位，使得脲酶失活。脲酶分子活性中心有2 個鎳離子，其中一個鎳離子在結構上是五配位的準四方錐構型，另一個鎳離子是六配位的準八面體構型[43]。不同的抑制劑可能作用于脲酶活性中心的鎳離子，也可能作用于其中的巰基，不同的結合方式使得活性中心形成空間位阻，從而抑制脲酶對尿素進行作用。表2列出了主要的UI及其作用機理。

2.2 人工合成硝化抑制劑

人工合成的NI 按照化學形態分為無機化合物和有機化合物兩大類。無機NI 以重金屬化合物為主，有機NI主要分為含硫化合物、乙炔及乙炔基取代物、氰胺類化合物、雜環氮化合物。常見的NI 見表3，生產中常用的NI 有以下幾種：氯啶類化合物，如2-氯-6-三氯甲基吡啶（Nitrapyrin），1974 年被美國DOW 公司開發為產品，商品名為N-server，在美國玉米種植帶應用較廣[53]；雙氰胺（DCD），由前西德SKW 公司發展為商品名為Didin 的產品[54]；3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP），于1999年由德國BASF 公司開發為產品，商品名為Entec[55]。

表2 常見的脲酶抑制劑Table 2 The commonly used urease inhibitors

土壤中硝化作用由微生物主導，NI 通過直接影響硝化微生物的酶活性從而抑制土壤中氨氧化或亞硝化過程，其抑制途徑主要有以下幾種[22，57]：

（1）將amoA中心的輔助因子銅螯合，從而抑制氨氧化微生物的活性[58-59]，如硫脲。

（2）屬于底物氨的競爭性抑制劑，能夠與底物氨結合，從而阻止微生物與氨結合，其中一類是競爭性抑制劑，即其結合氨的位點與AMO 結合氨的位點相同，也就是氨的類似物[60]，這類NI 有DCD、DMPP 等；另外一類物質與氨的結合是非競爭性的，其結合位點與AMO 結合氨的位點不同，該類物質是一類非極性的疏水物質，通過與其結合增大了AMO 的原子間排列空間位阻而阻止AMO 與氨的結合[22，60-61]，如烷烴類物質。

（3）一類基于機制的抑制劑，其與AMO 蛋白不可逆結合，通過共價修飾AMO 蛋白使AMO 失活，這些失活的蛋白需微生物重新合成才能再產生。如乙炔能使AMO中的一個單一蛋白被結合而永久失活[62-63]；而氯仿則能使AMO 的多種細胞組成成分被共價結合而抑制AMO 的活性[22]，因此較之單一蛋白被結合而使AMO失活更難被恢復[64]。

大部分的NI 通過抑制硝化作用過程中第一個步驟（氨氧化過程）中微生物的AMO 酶活性而達到抑制硝化作用的效果，而對NXR 步驟則沒有抑制效果。不過，一些生物硝化抑制劑（BNI）能同時抑制氨氧化過程和羥胺氧化過程，其作用強度和持續時間都優于人工合成NI，如植物合成的野櫻素、亞油酸、帶苯環的脂肪酸化合物都能同時抑制AMO 和HAO，且有的抑制作用可長達數月[65]。

2.3 生物硝化抑制劑

BNI 是自然界中某些植物根系分泌的具有較強硝化抑制能力的物質，Munrro 于1966 年在低氮的森林和草地土壤中發現，一直到2006 由Subbarao 創立了以相當于0.22 μmol·L-1的化學抑制劑烯丙基硫脲（AT）為單位的生物發光法才開啟了其量化研究[66-67]。一般的NI 都只能抑制硝化作用第一步反應的微生物酶AMO，而高粱及濕生牧草分泌的BNI 能同時抑制AMO及HAO的活性[68]。

非洲臂形牧草、高粱、小麥、水稻、豆類作物等植株均可分泌BNI[67-69]，這些抑制劑的類型有不飽和脂肪酸、野櫻素、癸二醇等。高粱根系分泌物中的對羥基苯丙酸甲酯（MHPP），是一種具有BNI 活性的苯丙酯類化合物[70]，可能是好氣的低氮生態系統中植物的一種自我適應能力。在高粱根系分泌物中還發現兩種具有BNI 活性的化合物Sorgoleone（一種苯醌類化合物），是疏水組分中主要的BNI；而Sakuranetin（一種黃烷酮類化合物）則是從高粱根系分泌物的親水組分中分離出來的[71]。此外，還有來自信號草Brachiaria humidicola 的根系分泌物Brachialactone（一種環二萜類化合物），由一個雙環戊二烯、一個環辛烷骨架、一個橋接五元環和八元環的γ-內酯環組成[68，72]。

影響植物分泌BNI的因素有氮素類型及濃度、土壤pH、硝化微生物類型及存在與否等。Zhang 等[73]報道，低濃度的銨態氮（0.1 mmol·L-1）誘導下，水稻根系癸二醇的分泌量是對照的2.4倍，低pH以及改善通氣狀況都會促進水稻根系分泌1，9-癸二醇（例如癸二醇的分泌量在pH 3.0 下是pH 7.0 時的2 倍）；此外，改善通氣狀況使癸二醇的分泌量增加了63%。水稻分泌的這種癸二醇主要通過抑制AMO 活性而抑制硝化作用，并且在水稻中發現了與非洲濕生臂形牧草相似的BNI編碼基因[74]。

同樣，BNI 由于延長了氮素以銨態氮形式存在于土壤中的時間，也對降低因硝化和反硝化作用排放的N2O 及減少硝態氮淋洗有顯著作用。研究表明，BNI與添加Nitrapyrin 的處理相比，N2O 排放量無顯著差異，其作用與化學NI 相當[75]。還有試驗表明，非洲臂形牧草根際的N2O 比大豆根際N2O 排放量低90%[68]，其抑制硝化作用的能力更優于人工合成NI。

表3 硝化抑制劑的類型及抑制機理[56]Table 3 The types of nitrification inhibitors and their mechanisms for inhibiting nitrification[56]

3 抑制劑對硝化微生物的影響

由于不同抑制劑的作用機理不同（螯合酶活中心的金屬離子、競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑、對酶活中心的空間位阻等），硝化微生物對其的敏感性也不盡相同，因此，各種抑制劑作用的有效濃度及在不同的環境條件下的作用效果有一定差異。不同抑制劑對AOB和AOA的豐度、多樣性及區系組成的影響，是隨近些年高通量測序及宏基因組技術迅速發展而興起的一個研究熱點。

有研究指出，不同抑制劑對氨氧化微生物的抑制強弱大體為乙炔＞DMPP＞硫脲＞Nitrapyrin，其中，乙炔不僅對AMO 功能基因有抑制作用，而且能抑制NXR功能基因[76]。乙炔在生產中一般包被于碳化鈣內使用，國內應用不多。由于一些NI 本身也含有氮素，也是一種氮源或碳源，剛施入土壤中可短期被反硝化微生物作為電子供體而影響反硝化微生物的一些細胞代謝活動，對反硝化作用不同作用步驟的微生物有一定影響[77-78]，而其對來自反硝化作用的N2O/N2的影響則取決于其對不同步驟及類別的反硝化微生物的相對影響程度，目前還沒有足夠的研究積累進行總結。

表4 總結了近年發表的關于抑制劑對硝化微生物影響的一些報道（關于UI，只收集到硫脲的報道），匯總結果顯示，大部分NI 都使中性至堿性土壤中AOB 的功能基因豐度顯著降低；而抑制劑對于土壤中AOA 的影響，則兩方面的報道都有，可能與土壤pH、基質濃度、施肥后取樣測定微生物豐度的時期、土壤黏粒含量、土壤水分狀況、土壤有機質含量等諸多因素有關。目前的研究報道數量還很有限，而且絕大部分的測定都是針對功能基因的DNA 水平進行的，而非RNA 水平的測定，因此，其反映的土壤中相關微生物的狀況可能與其實際具有活性的微生物水平還不盡一致，還需要再積累更多不同條件下的研究數據及具有活性的微生物功能基因的檢測研究，以進行進一步的分類匯總。

關于NI 對完全氨氧化菌的影響，目前的研究還很少，據Li等[95]報道，對pH 為近中性的澳大利亞農業菜地和草地2 個土壤的研究顯示，乙炔對2 種土壤的完全氨氧化菌都有顯著的抑制作用，其豐度降低了50%以上，尤其對農業土壤的完全氨氧化菌豐度抑制作用更強（豐度降低了近70%）；而二環辛烷對完全氨氧化菌豐度的影響不顯著。該研究還顯示，乙炔使2種土壤的AOB 和AOA 豐度也都顯著降低（10%到50%以上），其中AOB 豐度降低的幅度比AOA 更大，而且在農業土壤上的抑制效果高于草地土壤。

表4 主要的硝化抑制劑對硝化微生物及部分反硝化微生物功能基因豐度的影響Table 4 Effects of prevalent NIs on the abundance of functional genes of nitrifiers and some denitrifiers

由于UI 主要是抑制尿素的水解，一些硝化微生物也含有脲酶基因，因此一些UI 對硝化微生物豐度也有一定影響，但這方面僅有幾例報道[84，91，96]，這里暫不贅述。

4 抑制劑對土壤活性氮氣體排放的影響

由于UI 主要是抑制尿素水解為氨的過程，因此其抑制氨揮發的作用是直接的；而其抑制N2O 和NO排放則是由于抑制尿素水解后的間接作用，即土壤中硝化作用的基質較低的緣故。由于硝化作用同時釋放N2O 和NO，因此能抑制硝化作用的抑制劑，理論上對NO 也具有減排作用[97-99]。目前關于NI對N2O 減排的報道較多，而對NO 減排及3 種活性氮氣體同步監測的試驗很少。下面就目前查閱的一些文獻報道做簡要匯總。

4.1 抑制劑對氨揮發的減排/促進效果

UI 對降低氨揮發有顯著作用，通過對Ti 等[100]文章中的數據集進行重新分類匯總，得出不同的UI 對氨揮發減排的效果（與未施用UI 相比）依次為：PPDA（-47%）＞NBPT（-46%）＞氨基硫脲（-17.7%）＞HQ（-1.8%）。可見，抑制機理為螯合脲酶活性中心鎳離子的抑制劑，其減少氨揮發的效果最顯著，如磷酰胺類化合物PPDA 及NBPT；而醌類化合物對氨的減排作用較弱。Pan等[101]的meta分析結果與此類似。

NI 單獨施用，一般對氨揮發有促進作用。我們對文獻數據集[102]進行再匯總得到不同NI對氨揮發的促進作用為：N-server（194.2%，范圍29%～359%）＞DCD（44.8%，范 圍18.2%～71.5%）＞DMPP（5.3%，范圍-0.7%～11.3%），可見DMPP 對氨揮發的促進作用最小。其他文獻[101]匯總結果與此類似。

由于不同作物所處的氣候區（氣溫、降水）、環境條件（土壤類型、土壤pH、黏粒含量等）及相應的管理措施（施肥方式、耕作措施、灌溉與否）不盡相同，抑制劑對種植不同作物農田的氨揮發減排或促進作用有所差異。Ti 等[100]的meta 分析結果顯示，施用UI 對不同土地利用類型的氨揮發降低的效果表現為稻田（63%）＞小麥地（53%）＞玉米地（44%）＞草地（43%）；而單獨施用NI 對不同土地利用類型的氨揮發總體都有增加趨勢（有些研究結果也有減排氨的情況），具體為草地（101%，范圍-10%～351%）＞蔬菜地（49%，范圍-46%～312%）＞小麥地（31%，范圍-43%～204%）＞稻田（22%，范圍-25%～105%）＞玉米地（1%，范圍-99%～49%）。

4.2 抑制劑對N2O及NO的減排效果

從理論上來講，能抑制氨揮發的UI 及抑制硝化作用的NI，都能對NO 有協同減排作用，因為NO 與N2O 都在硝化作用及隨后的反硝化作用過程中產生。目前的研究中，關于抑制劑對NO 減排的文獻報道不多，已有的一些報道匯總如下：

（1）UI 對N2O 和NO 的協同減排：Akiyama 等[103]發現，UI（間二氮雜苯）使N2O 和NO 分別減排22.6%和36.1%。據Guardia 等[99，104]的報道，NBPT 在2 個不同年份使灌溉玉米地的N2O 和NO 分別降低了10.1%～57.6%和45.3%～71.3%，使雨養小麥地的N2O和NO排放分別降低了24.5%～63.3%和3.8%～10.9%。

（2）NI 對N2O 和NO 的協同減排：Akiyama 等[103]根據收集到的5 組研究數據得出，NI（DCD 和DMPP）使N2O 和NO 分別減排8.8%～46.7% 和25.7%～73.8%。此外，田間試驗表明，NI（Nitrapyrin和DMPSA）分別使雨養小麥地的N2O 和NO 分別減排12.9%～43.2%和49.2%～81.2%，且DMPSA 的減排效果優于Nitrapyrin[104]。還有研究顯示，DMPSA 還能使施用硝酸銨鈣的灌溉玉米地N2O和NO分別降低57.9%和12.5%～76.2%[99]。

（3）單一抑制劑對N2O減排的效果：生產上常用抑制劑的減排效果總體上表現為DMPP＞NBPT＞DCD≈Nytrapirin。如徐玉秀等[105]的meta 分析數據顯示，幾種抑制劑對N2O 減排的效果依次為DMPP（51.1%）＞NBPT（44.1%）＞Nitrapyrin（39.5%）≈DCD（38.9%）。Ruser 等[56]的meta 分析顯示，不同抑制劑的N2O 減排效果依次為碳化鈣（約46.5%）＞DMPP（約37.5%）＞Nitrapyrin（約32.5%）＞硫脲（約22.0%）。Thapa 等[106]的匯總分析結果為碳化鈣（約52%）＞DCD（43.5%）≈Nitrapyrin（約41%）＞DMPP（33%）＞硫脲（25%）＞NBPT（20%）。

4.3 抑制劑配合施用對活性氮氣體的減排效果

由于UI 對尿素水解和NI 對硝化作用的抑制作用，UI和NI配合施用對N2O 及NO 減排的作用總體優于單一抑制劑施用的效果。例如，徐玉秀等[105]根據收集到的86 組觀測數據的匯總結果顯示，不同抑制劑或抑制劑組合的N2O 減排能力（與無抑制劑相比）依次為HQ+DCD（58.9%）＞NBPT+DCD（52.9%）＞其他UI及NI單一施用。

一些為數不多的同步監測氨揮發和N2O 的研究顯示，UI 和NI 配合施用對氨揮發和N2O 總體減排的作用顯著，同時對減少硝態氮淋洗也有顯著作用。如Jiang 等[107]的試驗顯示，UI 與NI 配合施用使長江中下游小麥地的NH3及N2O 總減排量為51.4%，其對活性氮氣體的綜合減排作用相當于價格高昂的緩釋肥的效果，此外還比單一抑制劑顯著降低硝態氮淋洗，具有綜合減少氮素多途徑損失及總損失量的作用。孫祥鑫等[108]的研究表明，與單施尿素相比，水田土壤施用HQ、NBPT 和DCD 的氨揮發量分別減少了40.2%、43.2%和25.5%，N2O 排放量分別降低了28.9%、17.7%和35.9%，而施用DMPP 的氨揮發量增加了25.8%；施用HQ+DCD 和NBPT+DMPP 的氨揮發量分別減少了46.9%和71.9%，N2O 排放量也分別減少了54.7%和42.2%，分別比各抑制劑單獨施用對2 種活性氮氣體的減排效果都更好。

實際生產中一般會聯合使用UI 和NI，將其作為包膜材料包被于尿素顆粒外，謂之穩定性肥料，其對減少農田活性氮氣體排放，同時顯著減少硝態氮淋洗及提高作物產量的作用也比較顯著[102，109-110]，是綜合提高氮肥利用率且達到環境友好目標的合理選擇。

5 影響抑制劑作用效果的因素

抑制劑抑制農田活性氮氣體排放的效果除取決于抑制劑的抑制機理，同時還受溫度、土壤水分狀況、土壤類型、土壤pH、土壤質地、土壤有機質含量等諸多因素的影響。下面就抑制劑對抑制尿素水解及硝化作用的主要影響因素及對活性氮氣體減排的可能影響進行闡述，為生產中更好地發揮抑制劑的作用提供科學參考。

5.1 溫度

尿素水解是一種酶促反應，溫度升高一方面加快了酶分子的熱運動[111]，降低酶活性中心與底物分子形成復合體時的能級障礙[112]；另一方面，加快了UI自身的分解轉化，減弱UI對脲酶的抑制作用，進而加快酶-底物復合體的形成和解離[113]。有研究表明，土壤溫度升高，尿素的水解轉化作用增強，UI 的有效作用時間降低，抑制效應減弱[114]，其他研究也都證明了這一點[55，115-117]。

溫度一般是通過影響NI 的生物降解速率從而影響其抑制效果；但從另一方面來講，溫度低時硝化作用也弱，因此溫度對抑制劑抑制效果的影響需綜合分析。Menéndez 等[118]的試驗表明，抑制劑在高溫下容易分解，因此其效果一般在較高溫度時略低，且作用時間縮短。DCD 對于溫度較為敏感，而且DCD 本身也是一種氮源，在土壤溫度高于25 ℃時易被微生物降解，影響其作為抑制劑的效果[119]。還有試驗表明，DMPP 在高溫下容易分解，影響其作用效果，3個不同的溫度水平（15、25 ℃和35 ℃）下，15 ℃下DMPP 的作用效果最佳，并可維持40 d左右[120]。

5.2 土壤水分

土壤水分狀況影響尿素水解的速率及尿素的保留時間，進而影響UI 的抑制效果。有研究報道，NBPT 的抑制作用隨著時間的變化而降低，與土壤水分含量增加有關[121]。周旋等[114]研究顯示，尿素水解時間表現為60%WHC（9 d）＞80%WHC（6 d），脲酶抑制率也表現為60% WHC（45.9%）＞80% WHC（19.5%），說明隨土壤含水量的降低，尿素水解速度降低，使得尿素有效作用時間延長，脲酶抑制效應也增強。有研究報道，在7 mm 和14 mm 降水的土壤水分狀況下，NBPT 分別使氨揮發降低了77%和89%[122]。這說明，抑制劑的作用不僅與水分含量對抑制劑自身的抑制作用發揮有關，還與農田在不同水分含量下氨揮發的背景值有關。Sanz-Cobena 等[123]的研究也表明，在60% WFPS 下，NBPT 和苯基磷二酰胺使N2O 分別減排了83.2%和33.7%，NBPT抑制效果可長達9 d，苯基磷二酰胺只持續了3 d，而在80%WFPS下，兩種UI都沒有減少N2O的排放。

土壤水分對NI的抑制效果因NI本身特性的不同而存在差異。Nitrapyrin 在較濕的土壤中，會向土壤下層移動，在較干的土壤中，則會向表層移動，且在濕潤條件下，其揮發損失量也更大[124-125]。苯并三唑的硝化抑制效果不受土壤水分的影響，這與苯并三唑在土壤中不易被降解有很大關系[125]。而硝基酚、硝基苯胺、DCD 易被土壤微生物利用，而且DCD 的水溶性很高（13 ℃下水溶解度為22.6 g·L-1），在土體中移動性強，在遇強降雨情況下，容易發生與銨根分離的現象，甚至淋溶損失，從而影響其硝化抑制效果，還對環境造成影響[55]。研究發現，DCD 在土壤含水量為12%和24%時的抑制作用時長分別為90 d和60 d[126]。

5.3 土壤pH

NBPT 是實際生產中應用較多的UI，有研究報道，NBPT 在pH 分別為5.1、6.1、7.6 和8.2 的未滅菌土壤中，半衰期分別為0.07、0.59、2.70 d 和3.43 d[127]。Engel 等[127-128]發現，NBPT 的有效時長表現為堿性土（＞7 周）大于酸性土（2～3周），抑制率也表現為堿性土（86.2%）大于酸性土（17.0%），且與溫度相關。還有研究表明，對于堿性土，施用NBPT 顯著降低了土壤銨態氮含量，并維持了25 d，最大抑制率高達86.5%，相應地，土壤硝態氮含量也降低，并維持了48 d；而在酸性土中，NBPT 顯著抑制土壤銨態氮產生的作用僅維持了1 d，最大抑制率也僅為44.3%[129]。

土壤pH 對NI 抑制效果的影響較為復雜，一般來講，中性或石灰性土壤中的硝化作用比較強烈[130]，NI的作用可能會比較顯著；但在中性或微堿性土壤中，微生物的活性也較強，對NI 的分解也有可能會增加[131]。pH 降低會使環境中的銨發生質子化，降低基質的生物可利用性；pH 也主導著土壤中AOB 和AOA的生態位，不同微生物對其的敏感度不一樣。Thapa等[106]的文獻匯總結果顯示，NI 在不同土壤pH 條件下降低N2O 排放的效果依次為（括號中數字為添加抑制劑與不添加抑制劑的N2O 相對減排比例）：酸性土（57%）＞中性土（44%）＞堿性土（19%）。賴晶晶等[132]的研究結果顯示，4種主要的NI均能抑制土壤銨態氮向硝態氮的轉化和降低N2O 的排放，但抑制效果存在差異，對堿性土的硝化速率抑制效果表現為MHPP＞Nitrapyrin＞DMPP＞DCD，對酸性土則表現為MHPP＞Nitrapyrin＞DCD＞DMPP。還有研究表明，在以AOB 為主導的土壤中，Nitrapyrin 和NBPT 在pH＞5 時可以抑制AOB 豐度，并隨著pH 升高（pH 3.97～7.04）抑制效果增強，其他研究針對Nitrapyrin、DCD 及DMPP 等的結果與此類似[82，90]。

5.4 土壤質地

土壤質地決定土壤的孔隙條件，從而影響土壤的通氣性、水分含量以及有機質分解速率，進而影響土壤微生物的生長環境和基質供應。周旋等[133]的研究結果顯示，NBPT 和NPPT 對不同質地土壤中的尿素水解及其抑制效應表現為砂土＞黏土＞壤土，而對表觀硝化率及硝態氮含量抑制效應則表現為砂土＞黏土≈壤土，這與其對活性氮氣體減排效果直接相關，并且與不同質地土壤中產生的活性氮氣體在土壤中的逃逸擴散能力或土壤孔隙度有一定關系[134-135]。

硝化微生物一般都生活在土壤團聚體內部，因此，黏粒含量較高的土壤由于土壤微域對硝化微生物存在一定保護作用，有可能避免抑制劑對硝化微生物活性的抑制作用[136]。DCD 及DMPP 在抑制氮轉化方面的作用，在砂土上的抑制效果高于壤土和黏土[41，137]。Thapa 等[106]的文獻匯總結果顯示，NI 對N2O減排的效果在不同質地土壤上依次為：砂土（48%）＞中等質地土（40%）＞黏土（38%）。

5.5 土壤有機質含量

有機質含量高的土壤，其有機質對抑制劑有一定的吸附，該吸附一方面有利于抑制劑在土壤中的存留；但另一方面，又使得抑制劑受到了非生物學保護，且有機質含量高的土壤，反硝化微生物的活性也較強，抑制劑對土壤N2O 排放的綜合作用需全面考慮。有研究表明，NBPT 對尿素水解的抑制效果往往會隨著土壤有機質含量的減少而增加[115，138]。Suter等[139]的研究顯示，在土壤有機碳含量較高（11%）的草地土壤中，施用NBPT對尿素的水解速率影響不大，第14 d時尿素殘留率小于1%；而在土壤有機碳含量較低（＜1.5%）的小麥地中，施用NBPT 能有效降低尿素水解，第14 d 時尿素殘留率大于55%。

Barth 等[140]和Zhang 等[141]的研究均表明，抑制劑被土壤有機質吸附，可有效防止其在短時間內被土壤微生物降解和揮發，起到延長抑制時長的作用。有研究發現，去除有機質后土壤DMPP 半衰期是原土壤的3.8 倍，顯著延長了DMPP 的存留時間，從而顯著降低土壤表觀硝化率[142]。另外，有的AOA 可以利用有機物進行生長[143]；而有的AOA 則可利用無機碳進行生長，有機物反而會抑制其生長[26]；還有一種情況是，有機物可以充當氨氧化微生物生長代謝過程中的一些代謝酶，類似促進微生物生長的催化劑的作用，所以對AOA 可能起一定的促進作用[144]。因此，土壤中硝化微生物和反硝化微生物的群落組成結構，主要與土壤類型有關[145]，抑制劑及各種有機物不會明顯改變其微生物群落組成結構，但可能會對其組成比例有一定影響。

5.6 其他

抑制劑的作用效果還與抑制劑的用量、施用方法、氮肥類型、農田管理措施、作物類型等有關。在一定范圍內，隨著UI 用量的增加，其抑制效果逐漸增強[146]。張文學等[147]發現，隨著NBPT 添加量的增加，土壤脲酶活性遞減，當添加量超過尿素的1%時，效果顯著。然而，也有研究指出，有的土壤在PPD 和NBPT 的添加量達到尿素的10%時對尿素的水解才有顯著的抑制效果[148]。UI 與尿素配合深施能顯著降低氨揮發，meta 分析結果顯示，UI 與肥料深施和表施對氨揮發減排的效果分別為46%和37%[106，149]。當抑制劑未與土壤充分混勻，而是與氮肥表施時，其抑制效果通常較差，且抑制劑的添加量需要增加，這與抑制劑的揮發、降解及移動速度有關，如Nitrapyrin 易見光分解為6-氯-吡啶甲酸，造成揮發損失，不適合表施[150]。研究表明，田間條件下，DMPP 施用量為0.5～1.5 kg·hm-2時，其抑制時間可持續4～10 周[151]。DMPP的抑制效果和有效時長隨著DMPP 用量的增加而增強，但當DMPP增加到2%以上時，其抑制效果不再明顯[120]。也有研究顯示，DCD 和Nitrapyrin 均能夠顯著降低石灰性土壤N2O的排放，但施用2倍推薦量的Nitrapyrin并沒有顯著降低N2O排放量[152]。

6 展望

在多種措施綜合利用（比如結合肥料深施、多次施用等管理措施[106]）的情況下，人工合成的各種化學抑制劑對抑制氮素轉化過程中向大氣釋放活性氮的降低作用可以達到與緩釋肥類似的效果[100]，而其成本比緩釋肥低，推廣應用方面容易實現。此外，研究適合于水肥一體化系統的液體NI、大幅控制果樹及蔬菜等氮肥用量較高的生產系統中的活性氮氣體排放等方面也應該得到關注。

由于大部分BNI既能抑制氨氧化過程，也能抑制羥胺氧化過程[70]，而且還對側根生長有促進作用[153]，對環境的毒害較小，其未來應用前景可觀。篩選適合不同作物生長系統（如旱地、稻田）的適宜BNI，研究其分子結構、抑制機理、適宜濃度、植物產生這些BNI的影響因素及對作物生長的其他相關作用，以及對氮素轉化中N2O/NO 排放比值、氨揮發及硝態氮淋洗方面的同步監測與評估也需要開展更多的研究工作。此外，借助分子生物學技術，將具有高BNI 表達能力的植物基因轉入無分泌能力或低分泌能力的作物中，通過分子生物學技術降低土壤硝化作用的強度，并對土壤活性氮氣體排放起到抑制作用，將是提高氮素利用率、降低氮肥施用向大氣排放活性氮氣體的可能途徑[154]。

此外，由于不同氨氧化菌（AOB、AOA、完全氨氧化菌）的生態位條件不同，研究各種抑制劑對這些硝化微生物功能基因豐度、多樣性及群落組成結構的影響及其機理，以及這些影響與各種環境因子的關系，對進一步科學控制氮素硝化作用過程中活性氮的排放，也將會有更進一步的認識。