腐植酸鉀肥料對土壤細菌多樣性和養分的影響

丁嘉寧 梁利寶 王曰鑫

山西農業大學資源環境學院 太谷 030801

腐植酸是土壤中主要的有機碳庫，對土壤生物多樣性的改善有明顯的調控作用。腐植酸可通過改變根系分泌物（糖和有機酸）的種類和成分進而間接改變微生物群落結構[1]；腐植酸和肥料配施可提高根際土壤中細菌和真菌的數量[2]，不同種類的腐植酸對微生物的影響效果不同[3]；腐植酸還可以提高養分的利用率[4，5]。

凌愛芬[6]采用平板培養法說明添加少量腐植酸可以促進土壤細菌數量的增加，但隨著腐植酸用量增加，細菌數量開始下降，原因是腐植酸對微生物產生抑制作用。楊云馬等[7]研究得出土壤細菌數量與速效N、P含量呈極顯著正相關，與速效K呈顯著正相關。利用高通量測序技術研究細菌多樣性是一種現代的分子生物學法[8]，克服了傳統平板培養技術[9]的缺點，獲得了一部分不能分離培養的土壤微生物信息。此方法測序量大，準確度高，而且成本低，能夠大量節省試驗的人力、物力。但該方法可能會高估或低估一些細菌種群的相對豐度和多樣性。目前，國內采用高通量測序方法研究腐植酸肥料對土壤細菌種群影響的研究較少，因此本試驗采用此法揭示腐植酸對土壤細菌種群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試作物

供試作物為油菜“四月慢”，生育期約為40天，從山西省太谷縣農資市場購得。

1.1.2 供試肥料

腐植酸鉀肥料從市場購得，水溶性腐植酸含量為40%，N含量為 8.8%，P2O5含量為4.5%，K2O含量為10%。

1.1.3 供試土壤

供試土壤類型為石灰性褐土，采自山西農業大學實驗站，土壤的化學性質見表1。

表1 供試土壤的化學性質Tab.1 The chemical properties of tested soil

1.2 試驗設計

試驗在山西農業大學資源環境學院實驗站內進行，采用盆栽試驗，試驗用塑料盆規格為高22 cm，上口徑為20 cm，下口徑為17 cm，每盆裝入6 kg風干土。試驗共設4個不同腐植酸鉀肥料施用量處理，分別為0、5、10、20 g/kg土，分別用HA1、HA2、HA3、HA4表示，同時每盆施入基礎肥料尿素2克/盆，磷酸二氫鉀1克/盆，每個處理重復3次，采用完全隨機區組設計。于2019年5月7日播種，5月12日出苗，每盆保留4棵苗，于6月20日收獲，同時進行土壤樣品的采集，土壤鮮樣采集后立刻進行細菌多樣性的測定；待土壤風干后，進行土壤有機質和養分的測定。

1.3 測定項目及方法

土壤細菌多樣性采用高通量測序的方法測定（委托上海美吉生物科技有限公司測定）；土壤有機質采用NY/T 85-1988土壤有機質測定法標準中的重鉻酸鉀容量法測定；土壤全氮采用NY/T 53-1987土壤全氮測定法標準中的半微量開氏法測定；土壤全磷采用NY/T 88-1988土壤全磷測定法標準中的氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定；土壤全鉀采用NY/T 87-1988土壤全鉀測定法標準中氫氧化鈉熔融-火焰光度法測定。

1.4 土壤DNA提取和高通量測序

采用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對16s rRNA基因高變區（V3-V4）片段進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，引物序列[10]為 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。擴增條件為：95 ℃預變性2 min，接著進行5個循環，包括95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循環結束后72 ℃最終延伸5 min。每個樣品3次重復，將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用Quanti FluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量，按照測序量要求，之后將樣品互補DNA（cDNA）模板量濃度均一化至10 nmol/L后等摩爾混合，最后將混合液逐步稀釋至5 pmol/L后直接上機測序。測序在上海美吉生物科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺進行。

1.5 高通量測序指標及意義

使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接；得到的序列用Uparse軟件進行處理，根據97%的相似度對序列進行聚類，形成不同的分類單元，即為不同的OTU，使用Uchime軟件剔除嵌合體；利用RDPclassif i f i er軟件平臺對OTU進行物種分類，從而獲得每個OTU的分類學信息。

1.5.1 稀釋性曲線

稀釋性曲線可以用來比較測序不同的樣品中物種的豐富度，也可以用來說明樣品的測序數據量是否足夠，是否需要加測數據。當圖像變化越來越小甚至幾乎不變，證明測序數據量較為合理，各樣品的覆蓋率均較大，沒有被測出的序列概率極低，反映了本次測序結果真實度較高，具有分析意義。

1.5.2 Alpha多樣性分析

（1）計算菌群豐富度的指數：包括Chao指數與Ace指數，二者均是生態學中常用于估計菌群豐富程度的指標，它們可以估計物種總數。兩個指數與菌群多樣性均呈正相關關系，即Chao指數值與Ace指數值越大，則所含細菌越豐富。

（2）計算菌群多樣性的指數：包括Simpson指數與Shannon指數，二者均是生態學中常用于計算菌群多樣性的指數。兩個指數對群落種類的影響相反，即Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，則群落種類越多。

（3）測序深度的指數：Coverage指數能夠體現樣品被覆蓋的程度，與樣品的覆蓋率呈正相關關系。也就是說，Coverage指數值越高，樣品的覆蓋率越高，不能被檢測到的樣品幾率就越低。

1.5.3 物種組成分析

（1）Venn圖分析：可以直接通過觀察圖中OTU的數目和各樣品之間的相似度和重疊情況，研究各樣品物種組成的異同點。

（2）群落組成豐度：指群落中物種的數量多少，即細菌的豐富水平。

1.5.4 土壤養分與細菌OTU相關性分析

利用Spearman相關性熱圖分析土壤養分與細菌OTU的相關性，通過直接觀察群落熱圖中各指數的顏色深淺來判斷各個環境因子與細菌OTU之間的相關關系。

2 結果與分析

2.1 物種注釋與評估

為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDPclassif i er貝葉斯算法對一定相似度水平的OTU代表序列進行分類學比對分析，并在門水平（phylum）統計各樣品的群落組成。不同的OTU可以注釋為同一物種，此時該物種的豐度為對應OUT豐度之和。

2.1.1 稀釋性曲線

由圖1可以看出，橫坐標為隨機抽取測序樣品中的16s rDNA讀數，即樣品序列數（reads），其數值在不斷增加，而縱坐標表示的OTU的數量也隨之呈先快后慢的趨勢增大。當序列數為0～10000時，OTU數目增加速度比較快；當序列數在10000以后，OTU數目增加的速度逐漸變得緩慢；當取樣序列數達到30000以后，OTU數量的增加速度趨于平緩，其數量幾乎不再改變。因而說明選取的樣本數比較恰當，可以切實地反映土壤樣本的細菌群落，測序深度符合要求，能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of the samples

2.1.2 Alpha多樣性分析

表2是不同腐植酸鉀肥料處理后土壤細菌Alpha多樣性分析結果。可以看出HA2的Shannon指數、Ace指數和Chao指數是所有處理中最大的，而Simpson指數最小，說明了HA2的土壤細菌多樣性最豐富；HA4的Ace指數和Chao指數在3個不同用量腐植酸鉀肥料處理（HA2～HA4）中則是最小的，Shannon指數也較低，而Simpson指數最大，說明該處理土壤細菌多樣性最差；HA3的Shannon指數，Ace指數和Chao指數與HA4相比較大，而Simpson指數比HA4小。由此說明3個不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤細菌多樣性高于對照（HA1），且3個處理中細菌多樣性由高到低依次為HA2〉HA3〉HA4。由此得出，腐植酸鉀肥料明顯提高了土壤細菌多樣性。

此外，通過分析各樣品Coverage指數和稀釋曲線，不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤樣品Coverage指數均不低于0.9808，即覆蓋率均不低于98.08%，表明每個樣品的細菌種類信息基本上得到充分表現。

表2 Alpha多樣性分析Tab.2 Alpha diversity analysis

2.2 物種組成分析

2.2.1 Venn圖分析

由圖2中可以看出，4個不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤中共產生4451種OTU，其中4個不同用量腐植酸鉀肥料處理共同含有2564種OTU。HA1、HA2、HA3、HA4土壤中OTU數目分別為3339、3643、3491、3650，差異并不十分明顯，它們獨有的OTU數量分別為101、84、76、257，差異較為明顯。

綜上可分析出，HA4的OTU數量和獨有OTU數量均最多，HA2的OTU數量次之，但其獨有OTU的數量則僅高于HA3，低于HA1，獨有的OTU數量越多表示其含有獨特的細菌種類也最多。

圖2 OTU分布Venn圖Fig.2 Venn diagram of OTU distribution

2.2.2 群落組成豐度

圖3、圖4分別為OTU水平和門水平的細菌群落組成圖。從OTU水平來看（圖3），排在前5位的OTU分別是：OTU2914、OTU3151、OTU2799、OTU3463、OTU3451。HA3中的OTU2914含量最高3.12%，但與HA1、HA2相比差異不顯著。HA1、HA2中的OTU3151含量分別為2.56%、2.60%，二者之間無顯著差異，但顯著高于HA3和HA4。HA3中的OTU2799含量為3.60%，顯著高于HA1和HA2，HA4中則沒有OTU2799。HA1中的OTU3463含量顯著高于其他處理，其余3個處理中的含量基本相當。

圖3 細菌群落組成圖（OTU水平）Fig.3 Composition of bacterial community (OTU level)

從門水平來看（圖4），4個不同用量腐植酸鉀肥料處理的土壤細菌群落組成是基本相同的，并且它們的優勢菌門也相似，依次為：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chlorof l exi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。4個不同用量腐植酸鉀肥料處理的土壤變形菌門含量37.3%～43.8%，其中HA1含量較低；HA1的酸桿菌門含量（15.0%）顯著高于HA4的含量（11.1%）；HA2的土壤放線菌門含量（14.4%）要顯著高于HA3（10.2%）。不同用量腐植酸鉀肥料處理的綠彎菌門含量差異不顯著，均在10%左右；HA1的擬桿菌門含量（4.20%）則要低于其他處理（5.22%～6.35%），但差異并不顯著。

圖4 細菌群落組成圖（門水平）Fig.4 Composition of bacterial community (Phylum level)

隨著腐植酸施用量的增加，在OTU水平上，根據一定相似度進行聚類的OTU差異顯著；在門水平上，優勢菌門的豐度差異不顯著。綜上表明：腐植酸鉀肥料施入量的增加，改變了土壤菌群的結構，優勢OTU含量減少，降低了相似性，豐富了多樣性。

2.3 不同用量腐植酸鉀肥料處理對土壤有機質和養分的影響

從表3中可以看出，隨著腐植酸鉀肥料施用量的增加，土壤有機質和氮、磷、鉀含量也隨之增加。3個不同用量腐植酸鉀肥料處理間差異不明顯，但與對照均達顯著水平，說明腐植酸鉀肥料可以顯著提高土壤養分含量。

2.4 土壤養分與細菌OTU相關性分析

圖5為N、P、K 3種環境因子與不同細菌OTU之間的相關性。由圖可以看出，P、K 2種養分與OTU主要表現為正相關（棕色表示正相關，藍色表示負相關，且顏色越深相關性越強）。其中，P元素與OTU1266、OTU3665、OTU835、OTU4327正相關性較為明顯。K元素與多數OTU呈正相關性，其中與OTU2369和OTU329正相關性最明顯；與P、K元素相比，N元素與較多OTU呈負相關性，與OTU1154、OTU1366、OTU3304和OTU3991呈顯著負相關，與OTU1366和OTU3304呈極顯著負相關。結果表明：土壤養分對不同處理土壤樣品所含OTU的影響既有相似性，又有差異性。

表3 不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤有機質和養分含量Tab.3 Soil organic matter and nutrient content in potassium humate fertilizer treatment with different dosage

圖5 土壤養分與細菌OTU的Spearman相關性熱圖Fig.5 Spearman correlation heatmap of soil nutrient and bacterial OTU

3 結論與討論

（1）不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤中細菌群落組成和優勢菌群均較相似，優勢菌門依次為：變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門。原始土壤中酸桿菌門含量最高，HA4的變形菌門含量最高，HA2的放線菌門含量最高。張慧等[11]研究表明，施腐植酸肥料土壤變形菌門的相對豐度分別增加2.3%和2.8%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少；薛超群等[12]研究得出，隨腐植酸施用量增加，土壤放線菌數等微生物數量顯著提高，與本文結果相似。HA3、HA4放線菌門含量比HA2低可能因為腐植酸施入過多，造成有益微生物群落營養競爭，空間占領，產生抗生素、細菌素、胞外溶解酶等抑菌物質[13]。

（2）OTU2914、OTU3151、OTU2799是不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤含量最高的OTU。HA3的OTU2914含量最高3.12%，HA1的OTU2914含量最低為1.41%。HA4的OTU數量和獨有OTU數量均為最多，李想等[14]研究表明不同施肥類型土壤微生物的OTU數量差異明顯，有機肥處理明顯高于無機肥處理，有機肥處理土壤微生物特有OTU比化肥配施有機肥處理增加43.55%，說明有機質含量越高，微生物OUT數量也越多。而腐植酸屬于有機質，因此本試驗中腐植酸鉀肥料施用量最高的HA4的土壤中OTU數量較其他處理高。

（3）不同用量腐植酸鉀肥料處理提高了土壤有機質和養分含量，土壤中P、K 2種養分含量與OTU主要呈正相關，土壤N含量與細菌OTU主要呈負相關，尤其是N元素與OTU1366和OTU3304呈極顯著負相關。袁紅朝等[15]研究得出，N、P、K配施可顯著提高土壤細菌多樣性，與本文結果一致。試驗所得結果N元素與OTU呈負相關，可能是因為氮的沉降，短期氮沉降不足以打破土壤生態系統的平衡狀態[16]，長期氮沉降增加能提高土壤中NH4+濃度，降低土壤pH值，提高土壤Fe、Al等鹽基離子活性[17，18]，致使高氮沉降量對土壤微生物群落造成一定的毒害或抑制作用[19]。

本試驗只是針對土壤中細菌群落結構多樣性進行了研究，并未對真菌、病毒、原生生物等進行研究，因此不能全面反映腐植酸鉀肥料對土壤微生物群落結構的影響；本試驗的供試植物油菜生育期較短，不能長期反映土壤微生物隨時空動態變化，今后試驗要補充這方面的研究。