鉤吻總堿抑制人結腸癌細胞增殖及血管新生的作用研究

王文義 檀興慧 張萍萍 楊宇珂 黃梓泓 李德森 吳水生

摘 要 目的：探討鉤吻總堿（TAG）抑制人結腸癌細胞增殖及血管新生的作用。方法：體外培養人結腸癌細胞HT-29和人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），經低、中、高劑量TAG（40、80、120 μg/mL）干預后，使用倒置熒光顯微鏡觀察兩種細胞的形態，采用CCK-8法檢測兩種細胞的存活率，采用流式細胞術檢測HT-29細胞的周期變化情況，采用劃痕試驗、Transwell侵襲試驗和管腔形成試驗檢測HUVEC的遷移率、侵襲率和管腔數量。結果：與空白組比較，TAG各劑量組HT-29細胞和HUVEC均有不同程度的減少，并可見死亡細胞，兩者存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TAG各劑量組G2/M期HT-29細胞比例以及中劑量組G0/G1期細胞比例均顯著升高，而TAG各劑量組S期細胞比例以及高劑量組G0/G1期細胞比例均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TAG各劑量組HUVEC的存活率、遷移率、侵襲率均顯著降低，4～24 h各時間點管腔數量均顯著減少（P<0.01）。結論：TAG可抑制人結腸癌HT-29細胞和HUVEC的增殖，可改變HT-29細胞的周期，并抑制HUVEC的遷移、侵襲及管腔形成。

關鍵詞 鉤吻總堿;結腸癌;HT-29細胞;人臍靜脈內皮細胞;增殖;遷移;侵襲;血管新生

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the inhibitory effects of total alkaloids of Gelsemium elegans （TAG） on the proliferation and angiogenesis of human colon cancer cells. METHODS： Human colon cancer cell line HT-29 and HUVEC were cultured in vitro. After the intervention of low-， medium-， high-dose TAG （40， 80， 120 μg/mL）， the morphology of the two cells was observed by fluorescence inversion microscope. The survival rate of HT-29 cells and HUVEC was detected by CCK-8 assay. Flow cytometry was used to detect HT-29 cell cycle. The migration rate， invasion rate and tube number of HUVEC were observed by scratching test， Transwell invasion experiment and tube formation experiment. RESULTS： Compared with blank group， HT-29 cells and HUVEC were decreased to different extents in TAG groups; dead cells were observed， and the survival rate of both decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The proportion of HT-29 cells at G2/M phase in TAG groups as well as those at G0/G1 phase in medium-dose group were increased significantly; the proportion of HT-29 cells at S phase in TAG groups as well as those at G0/G1 phase in high-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Survival rate， migration rate and invasion rate of HUVEC were decreased significantly in TAG groups， and tube number was also decreased significantly at each time point during 4-24 h （P<0.01）. CONCLUSIONS： TAG have inhibitory effect on the proliferation of human colon cancer HT-29 cells and HUVEC， can change HT-29 cell cycle， inhibit the migration， invasion and tube formation of HUVEC.

KEYWORDS? ?Total alkaloid of Gelsemium elegans; Colon cancer; HT-29 cells; HUVEC; Proliferation; Migration; Invasion; Angiogenesis

結腸癌（Colon cancer，CRC）是常見的胃腸道惡性腫瘤，2018年全球CRC患者病死率和發病率分別位列惡性腫瘤的第2、3位[1]，且目前仍無有效防治CRC的措施。中藥防治CRC具有低毒、有效的特點，有一定的開發價值[2-4]。鉤吻[Gelsemium elegans（Gardn. et Champ.）Benth.]為馬錢科胡蔓藤屬植物，又名斷腸草、大茶藥、野葛以及胡蔓藤等，其具有良好的抗腫瘤、鎮靜、鎮痛、調節免疫功能等多種藥理活性，在腫瘤患者鎮痛和肝癌患者生存期延長等方面具有獨特的優勢[5-7]。鉤吻總堿（TAG）是鉤吻的主要成分之一，其既為活性成分，也是毒性成分。本課題組前期研究表明，TAG能抑制CRC細胞的增殖，并可抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的增殖與遷移，但具體作用及其機制尚不明確[8-10]。有研究指出，腫瘤細胞的存活與增殖依賴于血管生成[11]，而鉤吻及其活性成分能否影響CRC細胞的血管生成、且通過何種形式調控這一個過程，尚未見相關研究報道。鑒于鉤吻對CRC細胞的抑制活性，本研究初步探討了TAG在CRC血管生成中的作用及可能機制，旨在為鉤吻及其活性成分在CRC臨床治療中的應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

HF212 UV型CO2培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司）;Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司];FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）;IX70型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;TDZ4A-WS型低速水平離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鉤吻藥材購自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地，經福建中醫藥大學藥學院黃澤豪副教授鑒定為鉤吻真品。TAG凍干粉由福建中醫藥大學藥學院中藥藥效物質基礎實驗室制備（得率為0.6%）。

0.25%胰蛋白酶（批號：2048080）、胎牛血清（FBS，批號：1982158C）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號：8119049）、RPMI 1640培養基（批號：8119022）、青鏈霉素（批號：2019313）均購自美國Gibco公司;McCoys 5A培養基（江蘇凱基生物技術有限公司，批號：20190212）;CCK-8試劑盒（美國MCE公司，批號：30116）;碘化丙啶/核糖核酸酶（PI/RNase）染料（美國BD公司，批號：9039585）;Triton X-100試劑[愛必信（上海）生物科技有限公司，批號：J02N];結晶紫試劑（批號：1130P041）、Matrigel基質膠（批號：20190218）均購自北京索萊寶科技有限公司;二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人CRC HT-29細胞、HUVEC均購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

2 方法

2.1 藥液配制

取TAG凍干粉100 mg，溶于DMSO 4 mL中，配成質量濃度為25 mg/mL的TAG母液，于4 ℃保存，備用。臨用前用McCoys 5A完全培養基或RPMI 1640完全培養基（即含有10%FBS、1%青鏈霉素的McCoys 5A培養基或RPMI 1640培養基）稀釋至相應質量濃度。

2.2 細胞培養

將HT-29細胞和HUVEC分別接種至含McCoys 5A完全培養基和RPMI 1640完全培養基中，置于37 ℃、5%CO2條件下培養（培養條件下同）。

2.3 細胞形態觀察

使用倒置熒光顯微鏡觀察。取對數生長期的HT-29細胞、HUVEC各適量，經含EDTA的胰蛋白酶消化、計數后，以1.0×105個/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，培養，待細胞融合至50%～60%后，將其隨機分為空白組和TAG低、中、高劑量組[40、80、120 μg/mL，劑量參考已有文獻和TAG半數抑制濃度（IC50）[8，10]設置，下同]，每組設3個復孔。棄去培養基，空白組加入相應完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養基2 mL。培養24 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍攝細胞形態。

2.4 細胞活力檢測

采用CCK-8法檢測。取對數生長期的HT-29細胞、HUVEC各適量，經含EDTA的胰蛋白酶消化、計數后，以1.0×105個/mL按每孔100 μL接種至96孔板中，培養，待細胞融合至50%～60%后，將其隨機分為空白組、DMSO組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設6個復孔。棄去培養基，空白組加入相應完全培養基100 μL，DMSO組加入含DMSO 0.5 μL的完全培養基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養基100 μL。培養24 h后，加入CCK-8試劑10 μL，避光培養4 h，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計算細胞存活率：存活率=（空白組平均OD值-試驗組平均OD值）/空白組平均OD值×100%。上述試驗重復3次。

2.5 HT-29細胞周期變化檢測

采用流式細胞術檢測。取對數生長期的HT-29細胞適量，經不含EDTA的胰蛋白酶消化、計數后，以1.0×105個/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，培養，待細胞融合至50%～60%后，將其隨機分為空白組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設3個復孔。棄去培養基，空白組加入McCoys 5A完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的McCoys 5A完全培養基2 mL。培養24 h后，吸棄上清液，收集細胞，用4 ℃ PBS清洗后，置于70%乙醇中，于-20 ℃固定過夜，以1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS清洗后，加入含0.2%Triton X-100試劑的PI/RNase染料0.5 mL，避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況并使用Modfit 5.0周期擬合軟件進行分析。上述試驗重復3次。

2.6 HUVEC遷移能力檢測

采用劃痕試驗檢測。取對數生長期的HUVEC適量，經含EDTA的胰蛋白酶消化、計數后，以1×105個/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，培養，待細胞鋪滿后，用200 μL槍頭在每孔底部中央作一劃痕，用PBS清洗后，將細胞隨機分為空白組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設3個復孔。棄去培養基，空白組加入RPMI 1640完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的RPMI 1640完全培養基2 mL。分別于培養的0、24 h時拍照，并使用Image Pro-Plus 6.0軟件分析結果，計算遷移率：遷移率=（0 h時遷移距離-24 h時遷移距離）/0 h時遷移距離×100%。上述試驗重復3次。

2.7 HUVEC侵襲能力檢測

采用Transwell侵襲試驗檢測。取對數生長期的HUVEC適量，經含EDTA的胰蛋白酶消化、計數后，以1×105個/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，將其隨機分為空白組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設3個復孔。棄去培養基，空白組于小室上層加入RPMI 1640完全培養基200 μL，各給藥組于小室上層加入含相應藥物的RPMI 1640完全培養基200 μL，各組均于小室下層加入RPMI 1640完全培養基700 μL。培養24 h，棄去上清液，用棉簽擦拭上層底部未穿膜的細胞，用PBS清洗，以多聚甲醛溶液固定20 min后，加結晶紫試劑染色15 min，用PBS清洗，使用倒置熒光顯微鏡觀察，每孔隨機選擇5個視野，拍照并記錄染色細胞（染色后呈紫紅色的細胞即為發生遷移的細胞）數，同時計算侵襲率：侵襲率=試驗組遷移細胞數/空白組遷移細胞數×100%。上述試驗重復3次。