DPYD、GSTP1、MTHFR基因多態性對5-FU類基礎化療結直腸癌患者療效的影響

張杰,李昌海，李林子，王琴，方功，謝雄偉，韋智丹，張勇，廖秋霞

荊門市第一人民醫院，湖北荊門 448000

結直腸癌(CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，目前我國CRC的發病率正以年均4.2%的速度增長。據2015年中國癌癥統計數據顯示，我國CRC發病率分別位居男、女惡性腫瘤發病率的第三位和第二位[1]，嚴重威脅人民群眾的健康。化療仍是治療CRC主要手段，以5-FU類(氟尿嘧啶、卡培他濱和替加氟等)為基礎的化療方案是治療晚期CRC常用方案。但在臨床治療中發現CRC患者在接受以5-FU類為基礎的化療方案時，其化療療效及導致的腹瀉、口腔黏膜炎、骨髓抑制和心臟毒性等存在個體化差異[2]。5-FU類是一種抗代謝藥物，它對很多實體腫瘤有較好活性，其抗腫瘤活性是通過干擾DNA合成和mRNA翻譯來實現的。5-FU類藥物進入機體后，80%以上經肝臟和外周血單核細胞(PBMCs)中的二氫嘧啶脫氫酶(DPD)還原為二氫氟尿嘧啶，進而代謝生成尿素、氨和二氧化碳等終產物排出體外。僅1%～5%進入腫瘤細胞內，在磷酸激酶的催化下進一步轉化為活性代謝物氟脫氧尿苷-磷酸(FdUMP)、氟脫氧尿苷三磷酸(FdUTP)和氟尿苷三磷酸(FUTP)。FdUMP與胸苷酸合成酶(TS)及亞甲基四氫葉酸(CH2FH4)以共價結合形成三元復合物(FdUMP-dTMP-TS酶)，從而抑制TS活性，進而干擾DNA的合成。FdUTP和FUTP通過摻入DNA和RNA鏈中，破壞其結構和功能的完整性[3]。5-FU類藥物代謝過程中的各種關鍵酶的相應基因[如DPD基因(DPYD)、谷胱甘肽S轉移酶P1(GSTP1)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)等]多態性可能導致5-FU類藥物抗腫瘤作用和(或)不良反應的個體間差異[4]。因此，本研究將探討DPYD、MTHFR和GSTP1單核苷酸多態性是否可作為預測5-FU藥物化療療效評估、預后判斷的指標，為晚期CRC的個體化化療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取荊門市第一人民醫院2017年11月～2019年4月收治的90例接受化療的CRC患者。入選標準：經病理組織學證實的Ⅲ期、Ⅳ期(TNM分期)CRC；具有可測量的實體病灶；先前未進行過姑息性治療或既往使用新輔助或輔助化療(不含5-FU類)的結束時間距本次疾病復發時間≥6個月；KPS評分≥60分；預計生存時間≥3個月；化療前血常規、肝功能、腎功能正常；年齡≥18歲。 本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 化療方法 所有患者接受以5-FU類藥物(氟尿嘧啶、卡培他濱和替加氟等)為基礎的化療方案(FOLFOX、CapeOX化療方案)進行化療，其中FOLFOX方案(FOLFOX4方案26例、mFOLFOX6方案8例)34例、CapeOX方案56例。FOLFOX4：奧沙利鉑85 mg/m2第1天靜脈滴注2 h；亞葉酸鈣200 mg/m2第1天、第2天靜脈滴注；氟尿嘧啶400 mg/m2第1天、第2天靜脈推注，氟尿嘧啶600 mg/m2第1天、第2天22 h持續靜脈滴注，每2周重復。mFOLFOX6：奧沙利鉑85 mg/m2第1天靜脈滴注；亞葉酸鈣400 mg/m2第1天靜脈滴注；氟尿嘧啶400 mg/m2第1天靜脈推注，氟尿嘧啶1 200 mg/m2第1天、第2天22 h持續靜脈滴注，每2周重復。CapeOX：奧沙利鉑130 mg/m2第1天靜脈滴注大于2 h；卡培他濱：每次1 000 mg/m2，口服，每日2次，第1～14天，每3周重復。所有病例在化療3個周期后評價療效[5]。

1.3 療效評價 收集臨床資料并隨訪，評價化療療效及不良反應。至少完成3個周期化療評價療效(腫瘤進展除外)，行體格檢查、實驗室檢查和影像學檢查。按實體瘤療效標準(RECIST)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)和進展(PD)，以CR+PR為有效計算疾病控制率。不良反應評價參照WHO(1981年)標準。

1.4 DPYD、MTHFR和GSTP1基因分型檢測 所有熒光染色原位雜交測序檢測試劑均由北京華夏時代基因科技發展有限公司購買。應用TL998A型熒光染色原位雜交測序檢測系統(微測序基因分析系統，西安天隆科技有限公司)，直接讀取血液白細胞中的目標單核苷酸多態性位點。抽取2 mL靜脈血，置于EDTA抗凝管，上下顛倒混勻，再取100 μL加入事先配置好的NH4Cl預處理液離心管中，3 000 r/min離心5 min。吸走殘余液體，加入1 mL生理鹽水徹底重懸白細胞，然后室溫3 000 r/min離心5 min。將殘余液體吸干凈，向富集有白細胞的離心管中加入100 μL PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，用移液器反復吹打混勻直至成透明無團塊狀，室溫靜置20～30 min。各取1 μL經上述流程處理后的白細胞樣本，分別加入到DPYD(rs3918290、rs55886062)、GSTP1(rs1695)、MTHFR(rs1801133、rs1801131) PHARM-GENE 200 SNP分析樣品處理試劑，震蕩混勻，短暫離心。將待檢測的樣品處理試劑按照相應序號位置，置于實時熒光檢測儀(TL998A型熒光染色原位雜交測序檢測儀)中，選擇檢測基因類型，開始檢測。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。基因型分布由χ2檢驗分析是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，以P>0.05視為符合Hardy-Weinberg平衡。患者的一般資料和CRC化療方案療效的關系采用χ2檢驗；DPYD(rs3918290、rs55886062)、GSTP1(rs1695)、MTHFR(rs1801133、rs1801131)基因多態性與CRC化療方案療效的關系采用二元Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC患者DPYD、MTHFR和GSTP1基因多態性分布 入選的90例晚期CRC患者納入檢測，共檢測了DPYD(rs3918290、rs55886062)、GSTP1(rs1695)、MTHFR(rs1801133、rs1801131)3個基因共5個位點。其中DPYD(rs3918290、rs55886062)2個位點均為野生型，該樣本不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。GSTP1 rs1695基因型中AA型57例(63.3%)、AG型27例(30.0%)，GG型6例(6.7%)，等位基因A、G占比分別為78.3%、21.7%。MTHFR rs1801133基因型中CC型30例(33.3%)、TC型46例(51.1%)、TT型14例(15.6%)，等位基因C、T占比分別為58.9%、41.1%。MTHFR rs1801131基因型中AA型58例(64.4%)、AC型28例(31.1%)、CC型4例(4.4%)，等位基因A、C占比分別為80.0%、20.0%。經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，基因型GSTP1 rs1695(χ2=1.22，P>0.05)、MTHFR rs1801133(χ2=0.28，P>0.05)、MTHFR rs1801131(χ2=0.07，P>0.05)在這些人群中的分布符合遺傳平衡，沒有明顯偏離的分布，說明該研究資料具有群體代表性。

2.2 DPYD、GSTP1、MTHFR基因多態性與CRC患者近期療效的關系 90例晚期CRC患者治療后CR、PR、SD、PD分別為4、32、31、24例，總有效36例，總有效率為40.0%。患者性別、年齡、TNM分期、腫塊部位、化療方案(FOLFOX4、mFOLFOX6、CapeOX)和化療療效均無明顯相關性(P均>0.05)，詳見表1。90例CRC患者中，GSTP1 rs1695 AG+GG基因型患者化療失敗的可能性是AA基因型的3.193倍(OR=3.193，95%CI:1.307～7.804，P<0.05)，MTHFR rs1801133 TC+TT基因型患者化療失敗的可能性是CC基因型的4.000倍(OR=4.000，95%CI:1.431～11.180，P<0.05)；攜帶MTHFR rs1801131 AA、AC+CC基因型患者化療后有效率比較差異無統計學意義，詳見表2。

表1 以5-FU類為基礎化療晚期CRC 患者臨床病理特征與療效的關系(例)

表2 以5-FU類為基礎化療晚期CRC 患者GSTP1、MTHFR基因型與療效的關系[例(%)]

3 討論

5-FU類藥物是治療消化道腫瘤的基礎藥物，5-FU類藥物治療療效和耐受性方面存在個體差異的原因與其代謝相關的酶密切相關。研究發現，約80%的5-FU類藥物進入人體后在肝臟經由DPD降解失活，DPD是5-FU類藥物代謝的限速酶。因此，DPD活性高低直接決定了5-FU類藥物進入合成代謝和產生核苷酸類似物的量，進而影響5-FU類藥物治療療效[6]。DPYD作為DPD的編碼基因，其基因的多態性可導致DPD的結構及活性的變化，目前已證實的突變位點超過100個[7]，其中較為明確的與DPD缺陷相關的突變為以下幾個單核苷酸多態性：DPYD*2A(rs3918290)和DPYD*13(rs55886062)[8,9]。但本研究入選的90例晚期CRC患者，DPYD(rs3918290、rs55886062)2個位點均為野生型，不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，故未納入后續研究。DPYD*2A(rs3918290)的變異較多，而中國臺灣和日本的研究[10,11]與我們結果一致，表明國內或亞洲人DPYD基因型的多態性極低，后期可擴大樣本進一步研究。

MTHFR是葉酸代謝的關鍵酶，能將5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)并產生一個甲基基團。甲基基團是dTMP合成過程中的必需原料，同時參與5-FU類藥物在體內代謝的活性代謝物FdUMP和TS形成“FdUMP-dTMP-TS酶”三聚體復合物過程，進而抑制TS的生物活性，最終增強5-FU類藥物化療效果[12,13]。故MTHFR基因多態性與5-FU類藥物化療效果敏感性引起密切關注，其中研究最多也最常見的與MTHFR酶活性有關的基因多態性位點為MTHFR C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)。本研究結果顯示MTHFR rs1801133基因多態性與CRC患者以5-FU類為基礎的化療療效有顯著相關性，此結果與國內外相關研究報道一致[14,15]。但本研究發現MTHFR rs1801131基因多態性和療效無顯著相關性，這與部分報道[16]不一致，可能和本次樣本數量偏少以及患者的不同種族有關。

谷胱甘肽S轉移酶是一種可溶性的二聚體同工酶，具有強有力的催化效應，是體內生物轉化最重要的Ⅱ相代謝酶之一。它的主要功能是催化Ⅰ相酶代謝的親電子基團(包括多種化療藥物)與谷胱甘肽結合，使其成為水溶性物質而排出體外，消除它的細胞毒性。其同工酶家族中GSTP1廣泛存在于人體腫瘤組織中，在人體上皮來源的惡性腫瘤細胞中表達率較高，其活性變化與惡性腫瘤對化療藥物的敏感性相關[17,18]。研究表明，GSTP1參與5-Fu類和奧沙利鉑等多種化療藥物的解毒過程，故導致GSTP1活性下降的基因突變會增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[19]。本研究結果顯示,90例晚期CRC患者中，攜帶GSTP1 rs1695 AG+GG基因型患者化療失敗的可能性是AA型的3.193倍，提示GSTP1 rs1695基因多態性與CRC患者以5-FU類為基礎的化療療效有顯著相關性，此結果與相關研究報道一致[20,21]。

綜上所述，晚期CRC患者中與5-FU類藥物(氟尿嘧啶、卡培他濱和替加氟等)代謝途徑相關的關鍵酶基因(MTHFR、GSTP1)多態性與以5-FU類為基礎的化療療效有顯著相關性。結合本研究結果及既往的文獻報道，MTHFR rs1801133、GSTP1 rs1695基因多態性與CRC患者接受以5-FU類為基礎藥物化療的臨床療效具有顯著相關性。因此通過檢測MTHFR rs1801133、GSTP1 rs1695單核苷酸多態性有利于指導和預測CRC患者接受以5-FU類為基礎藥物化療的化療療效，為CRC患者的個體化治療提供依據。