結直腸癌患者血漿外泌體中miRNA-23b的表達及其臨床意義

閔貝貝 朱莉 曾娟

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為常見消化道惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均位居我國所有惡性腫瘤的第5 位，疾病負擔相當嚴重［1］。近年來，隨著外科手術、放化療、分子靶向治療及免疫治療的不斷進步，從一定程度改善了患者的治療效果，但CRC 的整體預后仍不能令人滿意［2］。研究［2-4］表明，對患者進行預后分層，制定個體化的治療策略，可有效改善患者的臨床結局。最近，外泌體作為腫瘤分子標志物的潛力逐漸受到重視。作為一種直徑約為30 ～150 nm 的微小膜泡，其內包裹有miRNAs，lncRNA 和蛋白質等多種生物活性因子，廣泛參與腫瘤惡性進程［5-7］。研究證實，外泌體“獨特”的被膜結構，可保護內含物不受膜外微環境中各種因子的影響而處于較穩定的狀態［8］。鑒于上述優點，血漿外泌體中miRNAs 的檢測已成為一種新興、可靠的生物標志物用于協助腫瘤的早期診斷和預后評估［9-10］。miRNA-23b（miR-23b）作為一個微小非編碼RNA，已被證實在CRC 的進展及轉移中扮演著重要角色［11-15］。然而，關于其在血漿外泌體中的表達及其臨床預后價值尚無報道。基于此，本研究擬檢測miR-23b 在CRC 患者血漿外泌體中的表達水平，并分析其與患者臨床病理學特征和預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2014年1月至2014年12月于武漢市中心醫院接受手術治療的CRC 患者為研究對象，其中，納入標準：（1）所有病例均經組織病理學確診為結直腸癌；（2）術前未接受過任何抗腫瘤治療；（3）具有完整的臨床病理資料。排除標準：（1）伴隨有其他惡性腫瘤；（2）未行根治性手術；（3）感染或妊娠。入院后采集3 mL外周靜脈血樣本于抗凝管中，并收集同期25例健康體檢者的3 mL血樣本作為對照。總共65例CRC 患者納入本研究，患者的所有臨床病理信息從電子病歷系統中進行采集。兩組人群的一般資料對比見表1，結果顯示，各組基線資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），具有可比性。在納入的腫瘤患者中，男36例，女29例，年齡為36 ～74 歲，平均（61.8 ±7.8）歲；術后腫瘤分期按照AJCC/UICC 第7 版TNM分期系統進行，其中Ⅰ期5例，Ⅱ期27例，Ⅲ期33例，納入患者的具體臨床病理特征見表2。本研究獲得武漢市中心醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者和家屬均簽署知情同意書。

表1 兩組患者的基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between two groups例

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的提取和鑒定采用ExoQuick Exosome Precipitation Solution（System Biosciences，CA，USA）試劑盒提取血漿中的外泌體。簡要步驟如下：取500 μL 血清樣本，加入126 μL 上述試劑，上下顛倒混勻，4 ℃孵育30 min 后于室溫下1 500g離心30 min，小心去除上清液，加入200 μL PBS 緩沖液重懸，即獲得血漿外泌體懸液。為了鑒定從血漿中提取的外泌體，首先采用透射電子顯微鏡（TEM）對外泌體的形態進行鑒定；然后利用Western Blot 檢測外泌體相關標志物（CD63，TSG101）的表達情況（以calnexin 為內參，其作為表達于內質網上的一種整合蛋白，在外泌體中不表達）；此外，使用NanoSight LM10（Malvern Instruments Inc.，UK）對外泌體的直徑和密度進行分析，具體操作步驟參照說明書進行。

1.2.2 血漿外泌體中RNA 的提取使用miRNeasy serum/plasma micro kit（Qiagen，CA，USA）進行血漿外泌體中RNA 的提取，所有步驟均在生物安全柜中進行，并在冰上進行操作，以預防RNA 降解導致提取的RNA 總量降低。參照既往文獻報道方法［16-17］，通過在每個血清樣本中添加25 fmol 的celmiRNA-39（Applied Biosystems，CA，USA）試劑進行均一化，以降低RNA 提取過程中樣品變異問題對最終檢測結果的影響。上述具體操作參照說明書進行。

1.2.3 RT-qPCR 檢測血漿外泌體中miR-23b 的表達水平采用TaqMan miRNA assays（Applied Biosystems，USA）試劑盒檢測血漿外泌體中miR-23b的表達水平，簡要步驟如下：取1 μg RNA按照cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems，USA）說明書進行逆轉錄反應合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），加入SYBR Green PCR Master Mix（Applied BiStudioystems，USA），進行PCR 擴增。RT-PCR 反應條件為：95 ℃，10 min 預變性；95 ℃，15 s 變性；60 ℃，1 min 退火延伸，45 個循環進行擴增，每個樣品重復3 次。以U6 為內參，以2-ΔCt計算miR-23b 的相對表達水平。所有引物均購買自Invitrogen（Thermo Fisher Scientific，USA）公司，序列如下：miR-23b（正向：5′-GAGCATCACATTGCCAGGG-3′；反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′）；U6（正 向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′；反向：5′-TTGCGTGTCATCCTTGCG-3′）。

1.2.4 隨訪采取門診復查或電話對患者進行定期隨訪，隨訪時間截止至2019年12月。其中，4例患者出現失訪，中位隨訪時間為65（27，72）個月。本研究觀察指標為5年生存期（overall survival，OS），定義為從明確診斷為結直腸癌開始至死亡或隨訪截止時間的時間間隔。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。采用χ2檢驗分析CRC 患者血漿外泌體中miR-23b 水平與臨床病理學特征的相關性；采用Kaplan-Meier 繪制不同血漿外泌體miR-23b 表達水平患者的生存曲線，組間差異采用Log-rank 檢驗進行比較；采用單因素和多因素Cox 比例風險回歸模型探究影響CRC 患者OS 的風險因素。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿外泌體的鑒定為了鑒定從血漿中分離的外泌體，筆者首先利用TEM 對外泌體的形態進行初步鑒定，結果見圖1A，健康人及CRC 患者血漿中提取外泌體均呈現典型的電鏡形態—茶托型或一側凹陷的半球形，大部分直徑在100 nm 左右，CRC 患者血漿中的外泌體數量較健康人多；Western Blot 結果表明，健康人和CRC 患者血漿中外泌體均表達CD63 和TSG101，而不表達Calnexin，且CD63 和TSG101 在CRC 患者血漿外泌體的表達水平較健康患者明顯升高，見圖1B；本研究進一步利用NanoSight 對外泌體的直徑和密度進行了測定，結果表明健康人和CRC 患者血漿中的外泌體的直徑范圍在50 ～200 nm 左右，主要集中在100 nm 周圍，且CRC 患者血漿中的外泌體的密度高于健康人，見圖1C。

圖1 結直腸癌和健康人血漿外泌體的鑒定Fig.1 Plasma exosomes identification from colorectal cancer and healthy controls

2.2 結直腸癌患者和健康人血漿外泌體中miR-23b的表達水平采用RT-qPCR對CRC患者和健康人血漿外泌體中miR-23b 的表達水平進行檢測，結果顯示，CRC 患者血漿外泌體中miR-23b 的表達水平較健康人顯著下調，差異具有統計學意義［（1.13±0.12）vs.（2.27±0.26），t=-28.490，P＜0.001］。

2.3 血漿外泌體miR-23b 表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系根據血漿外泌體中miR-23b 的表達水平，以中位值1.03 為界，將65例CRC患者分為高表達組（n=32）和低表達組（n=33），分析其表達水平與患者臨床病理特征的關系。結果表明，血漿外泌體miR-23b 低表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM 分期、脈管浸潤及神經侵犯顯著相關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及術前CEA 水平無顯著相關性（均P＞0.05），見表2。

2.4 血漿外泌體miR-23b 表達水平與結直腸癌患者預后的關系Kaplan-Meier 生存分析及Log-rank檢驗結果表明，血漿外泌體miR-23b 低表達組患者的病死率較高表達組明顯升高，差異具有統計學意義（χ2= 8.585，P= 0.003），見圖2。單因素分析結果顯示，腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、脈管浸潤、神經侵犯、TNM 分期和外泌體miR-23b 表達是影響CRC 患者OS 的危險因素（均P＜0.05），見表3。將上述因素納入Cox 比例風險回歸模型進行多因素分析，結果表明，TNM 分期（HR=4.205，95%CI：1.621 ～10.910，P=0.003）和血漿外泌體miR-23b表達（HR=2.243，95%CI：1.093 ～5.024，P=0.029）是影響CRC 患者OS 的獨立危險因素（均P＜0.05），見表3。

圖2 結直腸癌患者血漿外泌體中miR-23b 表達水平與總生存期的關系Fig.2 Relationship between miR-23b expression in plasma exosomes and overall survival of colorectal cancer patients

表2 結直腸癌患者血清外泌體中miR-23b 表達水平與臨床病理特征的關系Tab.2 Association of serum exosomal miR-23b level with clinicopathologic factors in CRC patients例

3 討論

作為一種新興的“液體活檢”技術，外泌體檢測具有樣本易采集、非侵入性和實時動態檢測等諸多優勢［18］。鑒于上述優勢，再結合外泌體miRNA 可在患者血清中保持穩定并具備反映腫瘤細胞獨特生物學特性的表達譜，使得外泌體miRNA成為了一種簡單、可靠的生物標志物，用于協助多種惡性腫瘤的早期診斷和預后評估［19-21］。本研究通過評估CRC 患者血漿外泌體中miR-23b 的表達水平及其與臨床病理特征和患者總生存期的相關性，首次證實血漿外泌體miR-23b 低表達與多種不良臨床病理因素相關，并預示著不良預后；在納入其他混雜因素后，血漿外泌體miR-23b 低表達仍是影響CRC 患者總生存期的重要因素。上述研究結果表明，血漿外泌體miR-23b 可作為預測CRC 患者預后的可靠標志物。

表3 影響結直腸癌患者總生存期相關風險因素的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analyses of risk factors related to overall survival of CRC patients

目前，腫瘤患者外周血循環中miRNA 被認為是一種簡單、有效的新興標志物［22-24］。KOU 等［13］的研究表明，與健康人相比，CRC 患者血漿樣本中的miR-23b 水平明顯降低，且其低表達不僅與腫瘤臨床分期，腫瘤深度，腫瘤復發和遠處轉移密切相關，還可用作CRC 診斷和預后評估的標志物。然而，新興證據證實裸露在血液循環中的miRNAs 可被內源產生的RNase 所降解，而外泌體中的miRNAs 由于有外泌體外膜“包裹”保護可免受RNase作用［25］。因此，相較于血液中的總miRNA，檢測血漿外泌體中的miRNA 能更好的反映患者外周血中的miRNA 水平。本研究通過檢測miR-23b 在血漿外泌體中的表達水平代替血清中總miR-23b，以評估循環miR-23b 在CRC 中的臨床預后價值，可提高循環miR-23b 檢測在患者預后評估中的準確性。關于外泌體miR-23b 在惡性腫瘤中的臨床意義，既往已有相關研究報道：KUMATA 等［26］分析了血漿外泌體miR-23b 在各個分期胃癌中的預后價值，結果發現，胃癌患者血漿中的外泌體miR-23b水平明顯低于健康對照組，且隨著腫瘤分期的增加，表達水平逐漸降低；生存分析發現，在Ⅰ～Ⅳ期胃癌中，血漿外泌體miR-23b 低表達均預示著較短的無疾病進展期和總生存期。上述研究結果提示，血漿外泌體miR-23b 可能是一個潛在的惡性腫瘤相關生物標志物。

關于miR-23b 參與CRC 發生進展的分子機制，目前研究仍較少。ZHANG 等［11］通過對結腸癌組織及細胞進行全基因組功能篩選后發現，miR-23b在人結腸癌樣本中顯著下調，其可通過靶向調控包括FZD7 和MAP3k1 在內的多個腫瘤轉移相關基因的表達，抑制腫瘤細胞的生長、侵襲以及新生血管形成，從而抑制腫瘤轉移；另一方面，GASIULè等［15］研究發現miR-23b 在奧沙利鉑耐藥的CRC 細胞高表達，其可通過促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，從而增加對化療藥物的抵抗性，促進腫瘤轉移。

盡管本研究首次探究了miR-23b 在CRC 患者血漿外泌體中的表達水平，并對其臨床預后價值進行了深入探究，但仍存在一些局限：（1）樣本量相對較小；（2）未對外泌體miR-23b 參與CRC 發生發展的分子機制進行探究。在未來，一方面，有必要開展大規模的臨床研究去進一步證實血漿外泌體miR-23b 水平在CRC 及其他瘤種中的臨床意義；另一方面，需要更多基礎研究去探索miR-23b特別是外泌體miR-23b 參與CRC 發生、進展及轉移的潛在分子機制。

綜上所述，本研究證實miR-23b 在CRC 患者血漿外泌體中表達顯著下調，且其低表達與多個不良臨床病理學因素及較短的總生存期密切相關，可作為一個CRC 的預后標志物和潛在的治療靶點。