lncRNA HSD52在卵巢癌組織中的表達及其對卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響

張瑜 吳美琴 涂紅勤 張清 曾友玲

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（武漢市婦幼保健院）婦科（武漢433016）

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、病死率高的特點，近年來有年輕化的趨勢［1］。目前卵巢癌仍缺乏早期有效的診斷方法，多數患者就診時已處于晚期，因而預后較差［2］。卵巢癌的發生、發展是一個復雜的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因失活等多種分子改變。長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是近些年新發現的生物體內長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA 分子，通過轉錄激活、染色質修飾、核內運輸、轉錄干擾等多種方式調控基因的表達［3-4］。有研究［5-7］表明，lncRNA 與人類各種腫瘤的發生、發展關系密切，在腫瘤如非小細胞肺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、胃癌等中均存在異常表達的lncRNA，其表達量與腫瘤的大小、臨床分期、預后顯著相關。越來越多的lncRNA 被發現參與卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、衰老等生物過程，更多的lncRNA 有待探索［8-9］。本研究首先通過檢測多個尚未報道研究的lncRNA 在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達，結果表明lncRNA HSD52在卵巢癌組織中的表達明顯降低，其表達可能與卵巢癌的發生、發展有關，因而lncRNA HSD52 在卵巢癌中的作用機制研究可能具有重要意義。本研究旨在檢測lncRNA HSD52 在卵巢癌組織和細胞株中的表達，觀察其對卵巢癌細胞生物學功能的影響，初步探討其分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年2月至2019年5月本院婦科73例卵巢癌根治性手術切除的癌組織和癌旁組織，術后立即于液氮中冷凍保存。所有標本均經本院兩名以上病理科專家確診?；颊吣挲g36 ～69 歲，平均（46.76 ± 9.52）歲。病理分型：漿液性癌41例，黏液性癌13例，子宮內膜樣癌10例；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期25例，Ⅲ期36例。所有患者術前均未行放化療，本研究經本院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞與主要試劑載有lncRNA HSD52 序列的質粒和陰性對照質粒購自上海吉凱公司。正常卵巢上皮細胞（IOSE80）和卵巢癌細胞株（OC3、A2780、OVCAR-3、HO-8910、SKOV-3）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。Matrigel基質膠購自美國BD 公司。RPMI 1640 培養基、DMEM 培養基和胎牛血清購自美國Gibco 公司。Transwell 小室購自美國康寧公司。轉染試劑LipofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司。噻唑藍（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自南京凱基生物科技發展有限公司。熒光實時定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。ECL 顯影液購自美國Thermo 公司。一抗（EDN3、α-Tubulin、p-ERK、AP-1、c-fos 和c-Jun）和二抗購自美國Abcam 公司。

1.3 細胞培養和質粒轉染IOSE80、A2780、HO-8910、SKOV-3 接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養基，OC3、OVCAR-3 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，于37 ℃、5%CO2濕潤培養箱中培養。將對數生長期的SKOV-3 細胞接種于6 孔板，待細胞密度達到30%時，采用LipofectamineTM3000 轉染試劑將載有lncRNA HSD52 序列的質粒和陰性對照質粒分別轉染至SKOV-3 細胞，分別命名為實驗組和對照組，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。轉染細胞6 h 后，更換新鮮培養基培養基。

1.4 RNA提取和熒光實時定量PCR（qRT-PCR）應用TRIzol 提取卵巢癌組織或細胞株的總RNA，檢測RNA 濃度和純度后，以RNA 為模板逆轉錄為cDNA。以GAPDH 為內參檢測lncRNA HSD52 和EDN3 mRNA 的表達，以U6 為內參檢測miR-498-5p的表達。GAPDH 上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；lncRNA HSD52 上游引物為5′-TGCCCTGGAAGGGACTAGA-3′，下游引物為5′-TTGCAAATGCTGTCCACTTG-3′；EDN3 上游引物為5′-ATTGCCACCTGGACATCATT-3′，下游引物為5′-GCAGGCCTTGTCATATCTCC-3′；miR-498-5p 上游引物為5′-GGGAAAGTTCGGTCCC-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR 反應參數為94 ℃預變性10 min，62 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環。獲得的數據運用2-ΔΔCt方法計算表達量。

1.5 MTT 法檢測SKOV-3 細胞增殖能力將對照組和實驗組SKOV-3 細胞分別接種于96 孔板，每孔200 μL，細胞密度為1×104個/mL。分別于接種后第1、2、3、4、5 天，每孔加入20 μL MTT 試劑（濃度為5 g/L），繼續培養4 h 后，棄去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖床振蕩25 min。酶標儀測定每孔在450 nm 波長處的光密度（OD）值。每個時間點設4 個復孔，實驗重復4 次。

1.6 Matrigel 侵襲實驗檢測SKOV-3 細胞侵襲能力應用Matrigel 膠包被Transwell 上室的微孔膜。將對照組和實驗組SKOV-3 細胞采用無血清培養基重懸后，分別接種于Transwell 上室，每孔200 μL，細胞密度為5 × 104個/mL。下室加入含10%FBS 的DMEM 培養基600 μL。培養24 h 后，用棉簽輕輕擦去微孔膜上室面細胞。多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS 溶液洗3 次。0.1%結晶紫染液室溫下染色30 min，PBS 溶液洗3 次。室溫下晾干后，在高倍顯微鏡下隨機選取4 個視野記穿膜細胞數，拍照并統計。實驗重復4 次。

1.7 生物信息學軟件預測lncRNA HSD52 的作用機制 應用LncBase Predicted v.2 軟件預測lncRNA HSD52 配對結合的miRNA，應用miRanda 軟件預測miRNA 配對結合的基因。

1.8 Western Blot實驗檢測EDN3蛋白的表達收集處于對數生長期的兩組SKOV-3 細胞，應用細胞裂解液提取各組細胞總蛋白。測定蛋白濃度后，以40μg/孔蛋白質進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳分離后的蛋白轉移到PVDF 膜上。應用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF 膜2 h，孵育一抗EDN3（1∶1 000 稀釋）、p-ERK（1∶1 000 稀釋）、AP-1（1∶2 000 稀釋）、c-fos（1∶2 000）、c-Jun（1∶2 000）及α-Tubulin（1∶1 000），在4 ℃下孵育過夜。次日洗膜后，在室溫下孵育二抗2 h，洗膜后應用ECL 顯影劑進行顯影曝光，α-Tubulin 為蛋白內參。

1.9 統計學方法應用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料均采用均數±標準差表示，組間均數比較采用t檢驗進行分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA HSD52 在卵巢癌組織和細胞株中均呈低表達qRT-PCR 檢測結果顯示，lncRNA HSD52 在73例卵巢癌組織和癌旁組織中的表達分別為0.76 ± 0.13 和5.18 ± 0.64。與癌旁組織相比，卵巢癌組織中lncRNA HSD52 的表達明顯降低（t=32.87，P＜0.01）。qRT-PCR 檢測結果顯示，lncRNA HSD52 在卵巢癌細胞株（SKOV-3、PC-3、C4-2B、22Rv1、DU-145）和正常卵巢上皮細胞IOSE80中的表達分別為0.69 ± 0.02、0.43 ± 0.02、0.79 ±0.02、0.31 ± 0.03、0.13 ± 0.02 和1.01 ± 0.07。與正常卵巢上皮細胞相比，lncRNA HSD52 在卵巢癌細胞株中的表達量明顯降低（P＜0.05），其中在SKOV-3 細胞中表達最低（P＜0.01），見圖1。

圖1 lncRNA HSD52 在卵巢癌細胞株和正常卵巢上皮細胞中的表達Fig.1 Expression level of lncRNA HSD52 in ovarian cancer cell lines and normal ovarian epithelial cell

2.2 轉染載有lncRNA HSD52 序列質粒上調SKOV-3 細胞中lncRNA HSD52 的表達轉染載有lncRNA HSD52 序列質粒后48 h，qRT-PCR 檢測結果顯示，實驗組和對照組SKOV-3 細胞中lncRNA HSD52表達量分別為10.37±1.58和1.01±0.07。與對照組相比，實驗組SKOV-3細胞中lncRNA HSD52的表達明顯上調（P＜0.01）。

2.3 上調lncRNA HSD52 抑制SKOV-3 細胞的增殖能力MTT 檢測結果顯示，在接種后第2、3、4、5天，上調lncRNA HSD52 的實驗組SKOV-3 細胞OD值明顯低于對照組（P＜0.05），表明上調lncRNA HSD52 可抑制SKOV-3 細胞的增殖能力，見圖2。

圖2 上調lncRNA HSD52 對SKOV-3 細胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of overexpression lncRNA HSD52 on the proliferation of SKOV-3 cells

2.4 上調lncRNA HSD52 明顯抑制SKOV-3 細胞的侵襲能力Matrigel 侵襲實驗結果顯示，實驗組和對照組SKOV-3 細胞穿過微孔膜的細胞數分別為43.10 ± 7.85 和94.58 ± 9.82，實驗組明顯低于對照組（P＜0.01），表明上調lncRNA HSD52 可抑制SKOV-3 細胞的侵襲能力。見圖3。

圖3 上調lncRNA HSD52 對SKOV-3 細胞侵襲能力的影響（100×）Fig.3 Effect of overexpression lncRNA HSD52 on the invasion of SKOV-3 cells（100×）

2.5 生物信息學軟件預測lncRNA HSD52 的分子作用機制應用LncBase Predicted v.2 軟件預測顯示，lncRNA HSD52 可配對結合miR-498-5p；應用miRanda 軟件預測顯示，miR-498-5p 可配對結合EDN3 mRNA，見圖4。

圖4 生物信息學軟件預測lncRNA HSD52 作用機制Fig.4 Bioinformatics technology predicts the mechanism of action of lncRNA HSD52

2.6 上調lncRNA HSD52 對SKOV-3 細胞中miR-498-5p 和EDN3 mRNA 表達的影響qRT-PCR 檢測結果顯示，實驗組和對照組SKOV-3 細胞中miR-498-5p 表達分別為0.19 ± 0.05 和1.00 ± 0.03，實驗組miR-498-5p 的表達明顯低于對照組（P＜0.01）。實驗組和對照組SKOV-3 細胞中EDN3 mRNA 表達分別為6.32±0.492 和1.01±0.06，實驗組EDN3 mRNA 的表達明顯高于對照組（P＜0.01），表明上調lncRNA HSD52 可降低miR-498-5p的表達，促進EDN3 mRNA 的表達。

2.7 上調lncRNA HSD52 對EDN3 蛋白和ERK 信號通路蛋白表達的影響Western Blot 檢測結果顯示，上調lncRNA HSD52 后，EDN3 蛋白表達水平增加，ERK 信號通路如p-ERK、AP-1、c-fos 和c-Jun 等多種蛋白的表達明顯降低，提示上調lncRNA HSD52 后ERK 信號通路轉導被抑制，見圖5。

3 討論

圖5 上調lncRNA HSD52 對SKOV-3 細胞EDN3 相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of high-expressed lncRNA HSD52 on the expression of EDN3 protein and related proteins in SKOV-3 cells

卵巢癌是威脅女性健康的最常見腫瘤之一，其異常的增殖和轉移能力是影響卵巢癌患者預后的重要因素［10-11］。lncRNA 最初被認為是RNA 聚合酶Ⅱ的副產物，屬于基因組轉錄的“噪音”，不能發揮任何生物學功能［12-13］。越來越多的研究顯示，lncRNA 在卵巢癌的發生、發展中發揮重要作用，有望成為卵巢癌診斷和治療的有效靶點［14-16］。YOU 等［17］研究發現，lncRNA DLX6-AS1 在卵巢癌組織中顯著高表達，通過靶向作用于miR-613，促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲。SHEN 等［18］通過比較卵巢癌組織和癌旁組織發現，LINC01627 在卵巢癌組織中的表達明顯增加，與卵巢癌患者的不良預后關系密切。lncRNA HSD52 是一種由1 094 個核苷酸組成的lncRNA，其對卵巢癌細胞生物學功能的影響并不明確。

本研究發現，與癌旁組織和正常卵巢上皮細胞相比，卵巢癌組織和細胞株中lncRNA HSD52 的表達均明顯下降，表明lncRNA HSD52 可能參與卵巢癌的發生、發展。MTT 法和Matrigel 侵襲實驗進一步顯示，上調lncRNA HSD52 可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，lncRNA HSD52 可能在卵巢癌細胞中發揮抑癌基因作用。lncRNA 發揮基因調控作用的重要分子機制之一是“競爭性內源RNA”，即通過競爭性結合內源性miRNA，干擾miRNA 與其靶基因mRNA 之間的靶向結合，間接促進靶基因mRNA 的翻譯［19-21］。lncRNA HSD52 在卵巢癌中的抑癌作用可能依賴于“競爭性內源RNA”機制。通過生物信息學軟件預測結果顯示，lncRNA HSD52 與miR-498-5p 之間存在結合位點，miR-498-5p 與EDN3 mRNA 之間存在結合位點。有研究表明，miR-498-5p 可明顯促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，降低腫瘤的放療敏感性，發揮原癌基因作用［22］。EDN3 基因位于染色體20q13，是血管內皮素家族成員之一，主要作用于細胞表面的內皮素受體B［23］。EDN3 蛋白在多種腫瘤中表達下調，其表達水平與患者的總生存期具有相關性［24］。EDN3 蛋白可抑制腫瘤細胞的增殖、轉移等生物功能，發揮明顯的抑癌基因作用［25］。本研究通過qRT-PCR檢測和Western Blot 實驗表明，lncRNA HSD52 過表達可降低miR-498-5p的表達，同時促進miR-498-5p 下游靶基因EDN3 的表達。本研究進一步發現，SKOV-3 細胞中EDN3蛋白表達增加后，ERK 信號通路蛋白如p-ERK、AP-1、c-fos 和c-Jun 的表達明顯降低，ERK 信號通路轉導被抑制，提示EDN3 蛋白可能通過抑制ERK信號通路發揮作用。下一步的研究方向是通過雙熒光素酶報告基因實驗明確lncRNA HSD52 與miR-498-5p 的靶向結合位點，驗證lncRNA HSD52在動物體內對卵巢癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。

綜上所述，本研究發現lncRNA HSD52 在卵巢癌組織和細胞株中低表達，上調lncRNA HSD52 可抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，其分子作用機制為特異性吸附miR-498-5p 調控EDN3 基因的表達。lncRNA HSD52 的研究可能為卵巢癌診斷和治療提供新的分子標志物及治療靶點。