熒光衍生化-磁分散固相萃取/高效液相色譜檢測池塘水與蔬菜中3種揮發性異味物質

陳 坤，張 鵬，王 妍，鄭振佳，董京磊，孫魯平， 朱樹蕓，趙先恩*

(1.曲阜師范大學 化學與化工學院，山東省綠色天然產物與醫藥中間體高校重點實驗室，山東 曲阜 273165； 2.山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；3.龍大食品集團有限公司，山東 煙臺 265200)

水體中的醇類揮發性異味物質(VOCs)主要包括2-甲基異莰醇(2-MIB)、土臭素(GSM)以及3-甲基-1-丁醇(3-MB)。隨著人們對VOCs研究的不斷深入，發現VOCs是產生水體污染的原因之一，且會影響飲用水、食品、養殖魚類的味道和口感。VOCs在各種水體中含量極低，通常無法通過嗅覺判斷其含量。因此，建立一種對VOCs進行高靈敏檢測及質量控制的方法具有重要意義[1-3]。

已報道的VOCs等揮發性有機物的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)以及分子印跡熒光位移法[4-8]。其中，GC法通常采用火焰光度檢測器、電子捕獲檢測器和火焰離子檢測器(GC-FID)對VOCs進行檢測，但靈敏度較低且基質效應嚴重。GC-MS法報道較多，但檢測靈敏度較低且儀器昂貴。分子印跡熒光位移法對VOCs的檢測雖具有特異性，但靈敏度較低且制備過程繁瑣。此外，VOCs的樣品前處理方法較多，包括閉環捕集(CLSA)、液液微萃取(LLME)、吹掃捕集(P&T)、固相微萃取(SPME)等。但上述樣品前處理技術對VOCs的研究結果往往難以令人滿意，或操作較為復雜，或使用成本較高。目前雖有分析2-MIB和GSM的少量報道，但鮮有同時分析2-MIB、GSM與3-MB的研究。

對于食品和環境分析，衍生化結合前處理技術能簡化樣品的制備、降低基質效應、提高檢測靈敏度，對食品安全監控和水體污染物的監測有重要意義[9]。磁分散固相萃取(MDSPE)技術可以選擇性吸附小分子有機物的衍生化產物，且萃取后易于分離收集，操作快速簡便[10]。氧化石墨烯具有超大的比表面積和良好的表面修飾性，可與化合物形成氫鍵、π-π堆積等作用[11]。使用磁性氧化石墨烯(MGO)進行MDSPE同時具有強吸附性和磁分離能力。因此，本研究建立了以6-碳酰氯左氧氟沙星(LFC-Cl)為衍生化試劑，MGO為MDSPE吸附劑的高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)分析方法。本方法實現了池塘水和蔬菜中前述3種VOCs的檢測，具有靈敏度高、樣品前處理簡單、儀器普適性好等優勢。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(配備四元梯度泵、在線真空脫氣機、熒光檢測器、自動進樣器、恒溫柱溫箱，美國Agilent公司)，RE-2000B旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，KQ2200E超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)，DF-2集熱式磁力攪拌器(金壇市成輝儀器廠)，真空干燥箱、高速萬能粉碎機(北京市永光明醫療儀器有限公司)，SC-06低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，XW-80A旋渦混勻器(上海精科實業有限公司)，SHA-C水浴恒溫振蕩器(金壇市金南儀器制造有限公司)。

左氧氟沙星(LFC，98.0%)、甲酸(色譜級，98.0%)、無水級1,2-二氯乙烷(99.8%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，99%)均購自阿拉丁公司，乙腈(99.9%，北京百靈威科技有限公司)，三氯氧磷(POCl3，山東西亞化學股份有限公司)，2-MIB(100 mg/L，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)，GSM(10 ng/L，英國LGC集團)，3-MB(99.0%，梯希愛化成工業發展有限公司)，其他試劑均為分析純。MGO參照本實驗室方法合成[10]。

1.2 LFC-Cl的合成

LFC-Cl的合成參照文獻[12-13]部分合成條件，并進行合成方案修改：向三頸燒瓶中加入1.0 g LFC和60 mL無水級1,2-二氯乙烷，用移液槍緩慢滴加2.2 mL POCl3，于85 ℃回流反應4 h。冷卻后加入0.05 g活性炭，于85 ℃再次回流20 min。趁熱過濾，除去活性炭，旋蒸除去溶劑得到LFC-Cl，置于真空烘箱中干燥8 h。干燥后的LFC-Cl產物可直接用于衍生化反應。

1.3 溶液配制

量取適宜體積的2-MIB、GSM、3-MB標準品，分別溶于乙腈得濃度為1.91×10-5mol/L的標準溶液，相應的低濃度溶液均由此標準溶液用乙腈稀釋得到。取一定體積的3種標準溶液配成濃度為4.78×10-6mol/L的混合標準溶液。準確稱取一定量DMAP溶于乙腈，得到濃度為0.20 mol/L的DMAP溶液。

1.4 衍生化反應

準確稱取6 mg LFC-Cl于安瓿瓶中，加入250 μL乙腈、400 μL待測物混合標準溶液(或實際提取樣品)、350 μL 0.05 mol/L的DMAP標準溶液，封口后，在60 ℃水浴中超聲波輔助條件(超聲波功率100 W，頻率40 kHz)下衍生反應90 min。衍生化反應示意圖見圖1。衍生溶液待進行MDSPE過程。

圖1 6-碳酰氯左氧氟沙星與含羥基揮發性異味物質的衍生化過程Fig.1 Derivatization reaction between LFC-Cl and hydroxyl-containing volatile organic compounds

1.5 MDSPE條件

MDSPE條件參考文獻的部分實驗方法[10,14]，并修改如下：將20 mg MGO加入衍生溶液后，置于25 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩20 min，在磁鐵作用下分離棄去上清液，用1 mL乙腈洗滌3次，加入1 mL洗脫劑乙腈(含1%甲酸)，在超聲波輔助條件(超聲波功率100 W，頻率40 kHz)下解吸3 min，在磁鐵作用下分離上清液，定容至1 mL，過0.45 μm有機相濾膜后稀釋進樣20 μL進行HPLC-FLD分析。

1.6 HPLC條件

色譜柱(CC)：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，美國Agilent公司)。流動相：A相為10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，B相為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序(GE)：0～6 min,2%B；6～10 min，2%～100%B；10～15 min，100%B。流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。熒光激發波長(λex)和發射波長(λem)分別為295、460 nm。

1.7 實際樣品處理

實際樣品處理參照文獻的部分處理方法[7,12,15-16]。

1.7.1 池塘水處理量取50 mL池塘水于分液漏斗中，加入5.0 g 氯化鈉固體，加入300 μL氯仿作萃取劑，萃取3次合并萃取液。用無水硫酸鈉脫水干燥后定容至1 mL，待衍生。

1.7.2 蔬菜樣品處理準確稱取15.0 g綠色蔬菜(生菜、萵苣、蔥)置于萬能粉碎機打碎，收集后加入7.5 mL乙腈渦旋2 min，超聲提取20 min。加入1.0 g氯化鈉和4.0 g無水硫酸鎂固體，渦旋5 min，以5 000 r/min 脫水15 min，待分層后準確吸取乙腈層，再次脫水后吸取乙腈層，待衍生化反應。

2 結果與討論

2.1 HPLC條件的優化

實驗對比了不同色譜柱(CC1：Agilent ZORBAX 300SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；CC2：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；CC3：依利特 SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；CC4：依利特HYPERSL C18(4.6 mm×100 mm，5 μm))，以及調整不同GE的分離效果，相同條件下平行測定3次(見圖2)。對CC考察結果表明，采用CC2分離時3種VOCs衍生物的峰面積最大(圖2A)。對GE考察結果表明，采用GE4時3種VOCs衍生物的峰面積最大(圖2B)，由于B相(含0.1%甲酸的乙腈)在0～6 min內已為2%，且能夠實現3種VOCs衍生物的基線分離，因此采用GE4作為最佳梯度洗脫程序。采用Agilent 1260 HPLC-FLD儀器的在線熒光光譜掃描功能，確定3種VOCs衍生物HPLC-FLD的最佳激發和發射波長分別為295 nm和460 nm。最終確定了“1.6”所述色譜條件，3種VOCs衍生物在15 min內可實現基線分離(見圖3)。

圖3 3種揮發性異味物質衍生物的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of three derivatives of volatile organic compounds LFC:levofloxacin(左氧氟沙星);LFC-2-MIB:derivatives of 2-methylisoborneol(左氧氟沙星-2-甲基異莰醇衍生物);LFC-GSM: derivatives of geosmin(左氧氟沙星-土臭素衍生物);LFC-Cl: 6-carbonyl chloride levofloxacin(6-碳酰氯左氧氟沙星); LFC-3-MB:derivatives of 3-methyl-1-butanol(左氧氟沙星-3-甲基-1-丁醇衍生物)

2.2 衍生化條件的優化

實驗同時考察了衍生化反應溫度、反應時間、DMAP濃度以及衍生試劑用量對3種衍生物峰面積的影響，得到揮發性異味物質衍生化溶液后分別平行測定3次。

對反應溫度和反應時間的考察結果表明：衍生物峰面積隨著反應溫度升高和反應時間的延長而增加，在60 ℃、90 min時峰面積達最大；繼續升高反應溫度或延長反應時間，衍生物的峰面積均減小(圖4A和4B)。這可能是由于反應溫度過高、反應時間過長使衍生產物發生分解所致。對DMAP濃度的考察結果表明：當DMAP濃度低于0.05 mol/L時，衍生物峰面積隨其濃度的增大而增加；DMAP濃度為0.05 mol/L時衍生物的峰面積達最大；但當DMAP濃度大于0.05 mol/L后，衍生物的峰面積隨其濃度的增加而減小(圖4C)。這可能是由于催化劑DMAP的濃度增大導致反應產物在強堿性條件下分解。對衍生試劑用量的考察結果表明：衍生物的峰面積隨衍生試劑用量的增加而增大，當衍生試劑用量為3種VOCs用量的1 500倍時，衍生物的峰面積最大，但繼續增大衍生試劑用量，峰面積反而減小(圖4D)。最終確定衍生化條件如“1.4”所述。

2.3 MDSPE條件的優化

實驗同時考察了MGO吸附劑用量(10、15、20、25、30 mg)、萃取時間(10、15、20、25、30 min)、解吸時間(1、2、3、4、5 min)和解吸劑種類(均含1%甲酸的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮)對萃取率的影響，得到異味物質衍生化溶液后分別平行測定3次。對吸附劑用量的考察結果表明：萃取率隨著吸附劑用量的增加而增加，當吸附劑用量為20 mg時，萃取率最大；繼續增加吸附劑用量，萃取率并無明顯增大。對萃取時間的考察結果表明：萃取率隨萃取時間的延長而增加，萃取時間為20 min時萃取率最大；繼續延長反應時間，萃取率并無明顯增大。對解吸時間的考察結果表明：萃取率隨解吸時間的延長而增大，解吸時間為3 min時萃取率最大；繼續延長解吸時間，萃取率并無明顯增大。對解吸劑種類的考察結果表明：以乙腈(含1%甲酸)作解吸劑時的萃取率最大，這可能是不同解吸劑的極性、目標分子溶解度等存在較大差異，乙腈(含1%甲酸)能夠更好地將異味物質衍生物從MGO中洗脫出來。最終確定MDSPE優化條件如“1.5”所述。

研究表明[11]，MGO對有機化合物的吸附機理主要是吸附劑與被吸附分子形成氫鍵、π-π堆積、靜電作用力、范德華力以及疏水作用等。本方法所使用的衍生試劑分子中存在可形成氫鍵的羰基、醚鍵、氟原子和氮原子等以及較大的共軛體系等結構，可與吸附劑形成上述作用力，因而產生良好的萃取效果。

2.4 方法評價

2.4.1 線性、檢出限、定量下限與精密度在空白水樣氯仿溶液中添加標準樣品，按照衍生化方法和MDSPE過程進行處理，根據峰面積(Y)和實際進樣濃度(X)進行線性回歸，并分別以信噪比S/N>3和S/N>10得到3種衍生物的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。為便于與其他方法及文獻中VOCs的檢測結果進行對比，將3種VOCs衍生物的數據換算為VOCs的數據，結果見表1。結果表明，3種VOCs在一定質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數r≥0.987，LOD為0.020～0.95 ng/L，LOQ為0.10～3.3 ng/L。已有文獻報道2-MIB和GSM的嗅味閾值約為10 ng/L[3]，本方法測得3種VOCs的LOD和LOQ均低于VOCs的嗅味閾值，表明本方法可用于極低含量的VOCs樣品檢測。

在相同實驗條件下，制備混合標準品衍生溶液，平行6次進樣分析，得到3種VOCs衍生物保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)均不大于1.7%(表1)。結果表明，本方法的精密度良好。

表1 3種異味物質的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量下限與相對標準偏差(n=6)Table 1 Linear equations,correlation coefficients(r),linear ranges,LODs,LOQs and RSDs of three VOCs(n=6)

Y:peak area;X:injection concentration(ng/L)

2.4.2 與文獻方法的比較與文獻方法相比，本方法所用的衍生試劑LFC-Cl易于合成并首次被應用于VOCs檢測。在檢出限、操作難易程度和儀器普適性等方面的對比見表2。

表2 本方法與文獻方法的比較Table 2 Comparisons of this method with the reported methods

*not reported(文獻中未對此種物質進行檢測)

結果顯示，在檢出限方面，本方法的檢出限低于或與LLE/GC-MS[4,17]和LLME/GC-MS[7]法的檢出限相近；而遠低于SPE/GC法[6]和分子印跡熒光位移/GC-MS法[8]。這一方面是由于本方法使用的衍生試劑LFC-Cl具有較大的共軛體系，從而為高靈敏檢測VOCs帶來良好的效果。另一方面，MDSPE技術能夠選擇性地吸附小分子有機物的衍生化產物，起到富集和凈化作用。在操作難易程度上，本方法使用的MDSPE與LLME、SPE等前處理方法相比無需特定設備，成本較低，且操作較簡單；MGO的制備步驟比分子印跡材料少，且適用于多種異味物質衍生物的同時吸附。在儀器普適性方面，HPLC-FLD的普適性較好。

2.5 回收率與實際樣品應用

以池塘水(取自曲阜市某池塘)和蔬菜(生菜、萵苣、蔥，購自曲阜某菜市場)為實際樣品，采用本方法進行前處理和實驗，同時進行加標回收率實驗。由表3可知，3種VOCs的回收率為76.8%～118%，能滿足實際檢測要求。實驗發現，蔬菜樣品中VOCs的含量較低，而池塘水中VOCs的含量較高。池塘水和蔬菜樣品中3種VOCs衍生物的色譜圖見圖5。另外開展了對自來水、紫菜、海帶等的適用性考察，測定結果的RSD均小于12%(n=5)。表明本方法的適用性良好，能夠應用于各種實際樣品中異味物質的檢測。

表3 兩種實際樣品中異味物質的含量及加標回收率(n=3)Table 3 Contents and recoveries of VOCs in two practical samples(n=3)

圖5 池塘水樣(A)與蔬菜樣品(B)中3種異味物質衍生物的色譜圖
Fig.5 Chromatograms of the three derivatives of VOCs in pond water(A) and vegetables(B)

3 結 論

本文利用衍生化技術結合磁固相萃取技術，建立了3種VOCs的HPLC-FLD分析方法。該方法具有靈敏度高、樣品前處理簡單、儀器普適性好等優勢。實際檢測結果表明，蔬菜中含有較少的VOCs，而池塘水中VOCs的含量相對較多。因此，需加強對各種湖泊池塘的管理和凈化，以降低VOCs對人類健康的危害，減少對生態環境的破壞。