基于適配體技術對止咳平喘健康產品中非法添加的沙丁胺醇進行可視化快速檢測

董嘉媚，劉亞雄，樊洪利，羅卓雅*

(1.廣州中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥數理工程研究院，廣東 廣州 510006；2.廣東省藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局 藥品快速檢驗技術重點實驗室，廣東 廣州 510663)

健康產品包括藥品、食品、保健食品、化妝品，是人們最基礎的日常生活用品[1]。沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)是一種常用平喘藥，屬于β2受體激動劑[2]。研究表明，長期服用沙丁胺醇會對人的神經系統(tǒng)產生危害[3-4]。一些不法商家為了謀取利益，向聲稱具有止咳平喘效果的中成藥以及保健品等健康產品中非法添加沙丁胺醇，嚴重損害消費者利益。

目前沙丁胺醇的常見檢測方法包括色譜法和光譜法[5-8]，如原國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的食藥監(jiān)食監(jiān)三[2016]28號文[9]《食品藥品監(jiān)管總局關于印發(fā)保健食品中非法添加沙丁胺醇檢驗方法等8項檢驗方法的通知》就采用了高效液相色譜法。但這些方法大多依賴貴重儀器、操作繁瑣、需要專業(yè)人員且無法進行現場檢驗。沙丁胺醇的現場檢測手段包括免疫法[10-13]和電化學法[14-17]，但免疫檢測中的抗體存在制備困難、價格昂貴、批間差異大等缺點[18-19]；而電化學法也沒有真正實現不借助儀器的現場快速檢測。

核酸適配體(簡稱適配體，Aptamer)是一種短的單鏈核苷酸(DNA或RNA)，對目標物具有高親和力和特異性[20-21]。近年來，適配體以其體外合成、易于修飾以及穩(wěn)定性高等優(yōu)點[21-25]受到越來越多的關注。

本實驗使用二氧化硅微球固定ssDNA結合蛋白(ssDNA binding protein，SSB)和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)，并利用二氧化硅微球的大比表面積實現信號放大。其檢測機理為，沙丁胺醇與SSB競爭與適配體結合，由于沙丁胺醇與適配體的親和性更高，使得SSB與適配體組成的“開關”被沙丁胺醇打開，磁分離后，游離的二氧化硅微球@SSB@HRP復合物與其作用底物發(fā)生顯色反應產生肉眼可見的結果。該傳感器制備方法簡單、靈敏快速、抗干擾性強，檢測過程僅需45 min，無需任何儀器，實現了真實樣品中非法添加沙丁胺醇的現場快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

磁力攪拌器(德國IKA公司)；Nano-60超微量紫外可見分光光度計(德國Implen公司)；離心機(美國Beckman Coulter公司)。

羧基化磁性微球(Magnetic beads，MB，直徑3 μm，10 mg/mL)購自上海英芮誠生化科技有限公司；羧基化二氧化硅微球(SiO2，直徑50 nm，50 mg/mL)購自北京中科雷鳴科技有限公司；ssDNA結合蛋白購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；乙醇胺和嗎啉乙磺酸(MES)購自上海麥克林生化科技有限公司；沙丁胺醇標準品購于上海源葉生物科技有限公司；辣根過氧化物酶、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和沙丁胺醇核酸適配體均購于上海生工生物科技股份有限公司；氨基修飾的沙丁胺醇適配體序列：5’-NH2-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTTGTAAAACTTAATCAGCGATTCTCTATGTCTGCAATTACCCTATGC GTGCTACCGTGAA-3’[26]；實驗用水為去離子水。

1.2 緩沖液配制

偶聯(lián)緩沖液(0.02 mol/L MES，pH 5.0)；適配體結合緩沖液(BB，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，pH 7.4)；TMB緩沖液(0.1 mol/L Na3C6H5O7，0.2 mol/L Na2HPO4，pH 5.2)；顯色液(30% H2O2、1 mg/mL TMB乙醇溶液與TMB緩沖液以體積比1∶100∶900混合，現配現用)。

1.3 實驗方法

1.3.1 磁性探針(MB-aptamer)的制備取0.1 mg MB分散于400 μL偶聯(lián)緩沖液中，向其中加入偶聯(lián)劑EDC-NHS(4∶1)至其最終質量濃度為10 mg/mL，室溫活化30 min，以偶聯(lián)緩沖液洗滌3次，除去多余偶聯(lián)劑；取5 μL 濃度為100 μmol/L的沙丁胺醇適配體，95 ℃水浴5 min，立即置入冰浴中延展10 min，隨后加入到活化的MB中，室溫下振蕩孵育1 h，得到磁性探針MB-aptamer；磁性分離，以偶聯(lián)緩沖液洗滌3次，用400 μL含有1%乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液將MB-aptamer重新分散，室溫下振蕩孵育1 h封閉MB上殘余羧基；磁性分離，BB洗滌3次，得到的磁性探針MB-aptamer懸于200 μL BB中備用。

1.3.2 二氧化硅微球-蛋白復合物(SiO2@SSB@HRP)的制備取5 mg羧基二氧化硅微球分散于900 μL偶聯(lián)緩沖液中，加入偶聯(lián)劑EDC-NHS(4∶1)至其最終質量濃度為10 mg/mL，室溫下活化30 min；5 000 r/min離心5 min，沉淀洗滌3次后重懸于400 μL偶聯(lián)緩沖液中；加入10 μL 10 μg/μL HRP和5 μL 2 μg/μL SSB，室溫振蕩孵育1 h；加入400 μL含有2%乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液，室溫下振蕩孵育1 h封閉二氧化硅微球上殘余羧基；5 000 r/min離心5 min，去離子水洗滌3次，所得復合物標記為SiO2@SSB@HRP，懸于200 μL BB中備用。

1.3.3 磁性探針與二氧化硅微球-蛋白復合物的連接(MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP)將上述得到的MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP混合，37 ℃振蕩孵育2 h；磁性分離吸棄上清液，BB洗滌3次，復懸后再于室溫振蕩孵育1 h，磁性分離吸棄上清液，BB洗滌3次，將結合不牢固的SiO2@SSB@HRP去除；最終得到的產物標記為MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP，分散于300 μL BB中作為檢測液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 沙丁胺醇的檢測取“1.3.3”制備的檢測液6份，每份50 μL，分別加入沙丁胺醇對照品和BB，使其最終體積均為100 μL，沙丁胺醇濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L，室溫下捕獲反應30 min；將6份待測液分別磁性分離，小心吸取上清液70 μL于新的1.5 mL EP管中；加入100 μL TMB-H2O2顯色液，觀察顏色變化，判定結果。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

如圖1所示，氨基修飾的沙丁胺醇適配體與羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)構成磁性探針MB-aptamer，二氧化硅微球負載HRP與SSB得到SiO2@SSB@HRP復合物，通過SSB與單鏈DNA(適配體本質是單鏈DNA)的結合作用將磁性探針MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP連接形成檢測復合物MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP。當待測液中存在適配體的靶標，即目標物沙丁胺醇時，由于SSB與適配體的親和作用(Kd=1.1 μmol/L)[27]小于適配體與沙丁胺醇的親和作用(Kd=53.60 nmol/L)[26]，因此沙丁胺醇將與適配體特異性結合，同時適配體與SSB的結合作用被破壞，即沙丁胺醇作為“鑰匙”，將適配體與SSB組成的“開關”打開。最終，檢測復合物MB-aptamer～SiO2@SSB@HRP產生MB-aptamer～SAL與SiO2@SSB@HRP兩部分產物，經過磁性分離，MB-aptamer～SAL位于EP管底部，而上清液中的SiO2@SSB@HRP復合物被吸取并與HRP的底物TMB進行反應，產生肉眼可見的藍色現象，從而可進行結果判定。

圖1 基于適配體傳感器檢測沙丁胺醇原理Fig.1 Detection of SAL by the developed aptamer sensor

圖2 SiO2@SSB@HRP復合物表征圖Fig.2 UV-Vis spectra of HRP(a),SSB(b) and SiO2@SSB@HRP(c)

2.2 SiO2@SSB@HRP表征

應用紫外-可見分光光度法對SiO2@SSB@HRP復合物進行表征。如圖2所示，SSB和HRP分別在270 nm和403 nm處有吸收峰(曲線a，b)，而SiO2@SSB@HRP復合物在波長270 nm和403 nm附近出現吸收峰(曲線c)，證明SSB、HRP負載成功，即SiO2@SSB@HRP復合物制備成功。

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 磁性微球與沙丁胺醇適配體比例優(yōu)化取0.1 mg磁性微球，分別與不同體積(1、2、5、8、10 μL)的適配體(濃度為100 μmol/L)進行實驗，發(fā)現體系吸光度隨著適配體體積的增加先升高后降低，當適配體體積為5 μL時獲得最大吸光度。因此選用0.1 mg磁性微球與5 μL適配體(100 μmol/L)制備MB-aptamer。

2.3.2 SSB與HRP比例優(yōu)化取5 mg二氧化硅微球，分別與SSB和HRP不同質量比的混合物(10∶1、1∶1、1∶10、1∶25、1∶50)進行實驗。結果表明SSB和HRP比例為1∶10時可獲得最大吸光度，因此選用SSB和HRP的質量比為1∶10。

2.3.3 二氧化硅微球與SSB及HRP的結合比例優(yōu)化取5 mg二氧化硅微球，分別與不同質量的SSB與HRP混合物(2、5、10、20、25 μg SSB分別對應與20、50、100、200、250 μg HRP混合)進行實驗。結果表明HRP取100 μg、SSB取10 μg時可獲得最大吸光度。因此選用5 mg二氧化硅微球與100 μg HRP、10 μg SSB制備SiO2@SSB@HRP。

2.3.4 MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP結合比例優(yōu)化取“2.3.1”優(yōu)化方案制備得到的200 μL MB-aptamer分別與“2.3.3”優(yōu)化方案制備得到的不同體積(50、100、200、300、400 μL)的SiO2@SSB@HRP進行實驗。結果顯示，吸光度隨著SiO2@SSB@HRP體積的增加先增加后趨于平緩，當SiO2@SSB@HRP的體積為200 μL時獲得最大吸光度，因此選用200 μL MB-aptamer與200 μL SiO2@SSB@HRP進行實驗。

2.3.5 顯色反應時間優(yōu)化為確定結果判定的最佳時間，對一系列反應時間的吸光度進行測定。發(fā)現當顯色反應時間為15 min時，吸光度達到最大值，因此選擇15 min作為顯色反應時間。

2.4 沙丁胺醇加標實驗

對一系列濃度梯度沙丁胺醇進行檢測，顯色反應產物用超微量紫外-可見分光光度計定量檢測。結果顯示，顯色反應產物的顏色隨沙丁胺醇濃度增加逐漸加深，當濃度達到10 μmol/L時，顯色反應產物的顏色由藍色變?yōu)榫G色。沙丁胺醇濃度在0.1～10 μmol/L(23.9～2.39×103μg/L)范圍內與體系吸光度呈良好的線性關系(r2=0.995 9)。通過一系列濃度梯度的加標實驗確定檢出限為0.1 μmol/L(23.9 μg/L)。與已報道的沙丁胺醇檢測方法以及原國家食品藥品監(jiān)督管理局關于保健食品中非法添加沙丁胺醇檢測標準相比(表1)，本文所構建的適配體傳感器具有較低的檢出限，滿足對止咳平喘健康產品中非法添加沙丁胺醇的檢測需求。此外，本方法操作簡單，可用于現場檢測。

表1 不同分析方法檢測沙丁胺醇的比較Table 1 Comparison of methods for SAL detection

2.5 特異性實驗

圖3 傳感器的特異性實驗Fig.3 Specificity against CLB and RAP concentration of SAL,CLB and RAP is 10，1，1 mmol/L, respectively

克倫特羅(Clenbuterol，CLB)、萊克多巴胺(Ractopamine，RAP)與沙丁胺醇的分子結構相似，都屬于β受體激動劑。因此用CLB和RAP考察傳感器的特異性。結果顯示，肉眼觀察濃度為1 mmol/L的CLB和RAP模擬樣品均未出現顯色反應。紫外-可見分光光度法驗證結果如圖3，二者檢測結果吸光度與空白相近，可忽略不計，表明所研制傳感器特異性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

制備5批次傳感器，同時測定10 μmol/L沙丁胺醇，相對標準偏差(RSD)為3.6%；使用同一批傳感器，連續(xù)5 d測定10 μmol/L沙丁胺醇，RSD為 5.2%，說明該傳感器具有良好的重現性。

表2 加標回收實驗結果Table 2 Results of recoveries

2.7 實際樣品中沙丁胺醇的檢測

為驗證所構建傳感器檢測實際樣品的可行性，采用標準加入法檢測止咳平喘中成藥中沙丁胺醇的回收率。取某品牌聲稱具有平喘作用的中成藥，高效液相色譜法驗證其為沙丁胺醇陰性。取此中成藥1片(0.5 g)，研成粉末，去離子水充分溶解后離心，取上清液，制備低、中、高3個不同水平的沙丁胺醇(表2)加標樣品，進行實驗。結果顯示其回收率為86.0%～106%，RSD在15% 以內，證明開發(fā)的適配體傳感器對實際樣品檢測具有應用前景。

3 結 論

本研究基于核酸適配體技術，通過大比表面積的二氧化硅微球固定SSB與HRP，達到信號放大作用，利用SSB與適配體結合的特點構建傳感器“開關”，基于沙丁胺醇與SSB之間對適配體結合的競爭作用，最終借助磁性分離獲得游離SiO2@SSB@HRP并催化TMB產生肉眼可見的顏色變化，建立了健康產品中非法添加沙丁胺醇的可視化檢測方法，檢出限為0.1 μmol/L。本方法具有快速、靈敏、肉眼可視、低成本且易操作的優(yōu)勢，可用于實際樣品中沙丁胺醇的可視化快速檢測。此外，只需改變適配體序列即可構建針對其它目標物的檢測傳感器，進一步擴展此傳感器制備方法的應用范圍。