舒尼替尼對結腸癌細胞Notch信號通路及細胞凋亡的影響

李 改,初大可

(西安交通大學第一附屬醫院消化內科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:chudake@xjtu.edu.cn)

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,發病率、死亡率極高,全球每年平均死于結腸癌的患者達60.8萬,發病率在男性、女性患者中分別居第三、二位[1,2]。近年來,我國結腸癌發生率快速升高,嚴重威脅人民生命健康[3,4]。目前臨床上通過手術、化療、放療、生物治療等方法治療結腸癌,但效果及預后不盡如人意,患者5年生存率僅42.7%[5]。因此,尋找更安全高效的抗腫瘤藥物仍然是結腸癌治療的研究重點[6]。舒尼替尼是一種小分子多靶向酪氨酸激酶抑制劑,是一種多靶點的生物靶向抗腫瘤藥物,對治療胃癌等腫瘤療效顯著[7]。舒尼替尼在治療中對腫瘤分子信號調控網絡的作用機制仍有待于深入研究。Notch信號通路是細胞間傳導信號的保守通路,是決定細胞命運、組織發育的關鍵信號通路之一[8]。近來研究發現,Notch信號在腫瘤發生發展過程中起關鍵作用[9,10]。而Notch信號通路是否在舒尼替尼治療結腸癌中發揮作用仍需研究證實。因此,本研究將探究舒尼替尼對結腸癌細胞株SW480中Notch信號通路分子及細胞凋亡的影響,以期為舒尼替尼治療結腸癌的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

結腸癌細胞株SW480、RPMI1640培養基、胰蛋白酶、化學發光試劑盒,購自上海澤葉生物科技有限公司;胎牛血清、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、GAPDH抗體、Notch1抗體、N-myc下游調節基因4(N-myc downstream regulated gene 4,NDRG4)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG,均購自上海恒斐生物科技有限公司;舒尼替尼(12.5 mg×28粒/盒,國藥準字:H20090030)購自輝瑞公司;青霉素、鏈霉素、Notch4抗體、P53抗體,均購自廈門慧嘉生物科技有限公司;CCK-8試劑、Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒,均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 細胞培養與分組

將結腸癌細胞株SW480培養于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養基中,37 ℃、5% CO2培養,待細胞貼壁生長融合達到70%-80%,用胰蛋白酶消化、傳代培養。取對數期SW480細胞,以1×105個/ml、100 μl/孔接種于96孔培養板,實驗分組為:對照組,0.75 μmol/L舒尼替尼組,1.5 μmol/L舒尼替尼組,3.0 μmol/L舒尼替尼組,6.0 μmol/L舒尼替尼組。

1.3 CCK-8法檢測各組SW480細胞增殖

設置空白對照組(只加培養基),培養各組SW480細胞,分別于培養24,48,72 h后向各組培養基中加入CCK-8試劑,繼續培養2 h,采用全自動酶標儀(波長:490 nm)檢測各孔吸光度值(OD)。計算各組SW480細胞在不同濃度舒尼替尼作用下的增殖抑制率,增殖抑制率(%)=(OD對照組-OD舒尼替尼組)/(OD對照組-OD空白對照組)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測各組SW480細胞凋亡

按1.2分組培養細胞,48 h后收集各組SW480細胞,用胰蛋白酶消化、PBS洗滌,使用400 μl 1×結合緩沖液重懸細胞,轉移至離心管中,并調整細胞濃度為1×106個/ml,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC、5 μl PI,避光孵育15 min,于流式細胞儀中檢測細胞凋亡率。

1.5 流式細胞儀檢測各組SW480細胞周期分布

按1.2分組培養細胞,48 h后收集各組SW480細胞,胰蛋白酶消化,PBS洗滌,-20 ℃預冷的70%乙醇固定過夜,收集細胞,PBS洗滌,加500 μl RNase/PI重懸細胞,避光染色20 min,于流式細胞儀中檢測細胞周期分布情況。

1.6 Western blot法檢測各組SW480細胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達

按1.2分組培養細胞,48 h后收集各組SW480細胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白,BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度并定量,十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質,轉移至PDVF膜上,含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,加入一抗(1 ∶500稀釋的Notch1抗體、Notch4抗體、P53抗體、NDRG4抗體、Bax抗體和1 ∶1 000稀釋的GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入二抗(1 ∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h,TBST洗滌,化學發光法顯影,Tanon 600圖像分析系統拍攝圖像,并分析蛋白條帶灰度值,蛋白相對表達水平=目標蛋白灰度值/內參GAPDH蛋白灰度值。

1.7 統計學分析

數據處理采用SPSS 24.0統計學軟件。計量資料采用均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。當P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SW480細胞增殖情況

CCK-8法檢測結果顯示,各組SW480細胞分別培養24,48,72 h的OD值,計算細胞增殖抑制率。結果顯示,隨著培養時間的增加,各組SW480細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。同一時間點,與對照組相比,不同濃度舒尼替尼組SW480細胞增殖抑制率均顯著升高;隨著舒尼替尼濃度升高,SW480細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05,見表1)。

2.2 SW480細胞凋亡情況

流式細胞儀檢測各組SW480細胞培養48 h的凋亡率,結果顯示:與對照組相比,不同濃度舒尼替尼組SW480細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05),且隨著舒尼替尼濃度升高,SW480細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05,見圖1、表2)。

表1 SW480細胞增殖抑制率比較 (n=6,%)

Table 1 Comparison of inhibition rate of SW480 cell proliferation among five groups (n=6,%)

組別 24h48h72h對照組5.54±1.469.93±3.27e19.05±4.39ef0.75μmol/L舒尼替尼組8.23±2.53a18.98±4.12ae30.23±5.44aef1.50μmol/L舒尼替尼組17.86±3.94ab27.53±5.16abe49.65±6.38abef3.00μmol/L舒尼替尼組24.53±5.06abc44.19±5.97abce60.07±7.12abcef6.00μmol/L舒尼替尼組41.24±5.74abcd54.67±6.64abcde78.74±8.34abcdef F74.67774.69080.291 P<0.001<0.001<0.001

與對照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05;與24 h相比,eP<0.05;與48 h相比,fP<0.05

圖1 舒尼替尼對SW480細胞凋亡的影響

表2 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細胞凋亡率比較 (n=6)

Table 2 Comparison of apoptosis rates of SW480 cells among five groups (n=6)

組別 細胞凋亡率(%)對照組5.03±1.220.75μmol/L舒尼替尼組11.36±2.65a1.50μmol/L舒尼替尼組34.48±5.63ab3.00μmol/L舒尼替尼組52.69±9.85abc6.00μmol/L舒尼替尼組73.82±10.26abcd F101.324 P<0.001

與對照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05

2.3 SW480細胞周期分布

流式細胞儀檢測各組SW480細胞培養48 h的凋亡率,結果顯示:與對照組相比,不同濃度舒尼替尼組G0/G1期SW480細胞比例均顯著升高(P<0.05),S期、G2/M期SW480細胞比例均顯著降低(P<0.05)。隨著舒尼替尼濃度升高,G0/G1期SW480細胞比例均顯著升高(P<0.05),S期、G2/M期SW480細胞比例均顯著降低(P<0.05,見圖2,表3)。

2.4 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白的表達情況

Western blot法檢測各組SW480細胞培養48 h后Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達水平,結果顯示:與對照組相比,不同濃度舒尼替尼組SW480細胞中Notch1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05),Notch4、P53、NDRG4和Bax蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。隨著舒尼替尼濃度的升高,SW480細胞中Notch1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05),Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05,見表4,圖3)。

圖2 舒尼替尼對SW480細胞周期的影響

表3 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細胞周期分布情況比較 (n=6)

Table 3 Comparison of cell cycle distribution of SW480 cell among five groups (n=6)

組別 G0/G1(%)S(%)G2/M(%)對照組27.68±4.2252.5±4.9322.78±3.490.75μmol/L舒尼替尼組39.86±4.85a43.58±4.67a17.42±3.26a1.50μmol/L舒尼替尼組48.33±5.08ab36.47±4.13ab13.29±3.08ab3.00μmol/L舒尼替尼組55.16±5.22abc29.61±3.68abc9.16±2.67abc6.00μmol/L舒尼替尼組63.23±5.38abcd22.73±3.51abcd5.88±2.14abcd F45.96844.75630.376 P<0.001<0.001<0.001

與對照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05

表4 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達比較 (n=6)

Table 4 Comparison of Notch1, Notch4, P53, NDRG4, Bax protein expression in SW480 cells among five groups (n=6)

組別 Notch1/GAPDHNotch4/GAPDHP53/GAPDHNDRG4/GAPDHBax/GAPDH對照組0.76±0.120.14±0.050.16±0.060.11±0.030.21±0.040.75μmol/L舒尼替尼組0.58±0.11a0.23±0.07a0.29±0.07a0.24±0.05a0.28±0.06a1.50μmol/L舒尼替尼組0.44±0.10ab0.45±0.09ab0.42±0.08ab0.32±0.06ab0.39±0.09ab3.00μmol/L舒尼替尼組0.32±0.08abc0.58±0.10abc0.56±0.08abc0.52±0.11abc0.56±0.14abc6.00μmol/L舒尼替尼組0.21±0.06abcd0.73±0.12abcd0.69±0.11abcd0.75±0.15abcd0.85±0.19abcd F30.14244.53439.72845.48328.465 P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

與對照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05

圖3 舒尼替尼對SW480細胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達水平的影響

3 討論

結腸癌是世界三大常見惡性腫瘤之一,嚴重威脅人類生命健康[11]。舒尼替尼是一種多靶點的生物靶向抗腫瘤藥物,通過抑制多條信號轉導通路發揮作用[12]。研究證實,舒尼替尼在腎癌、肺癌化療中的療效及安全性值得肯定,但對于結腸癌的作用尚鮮有報道[13,14]。季流等[15]研究表明,舒尼替尼聯合FOLFOX4治療轉移性結腸癌患者的療效和安全性值得肯定,但其作用機制尚未完全明確。本研究結果顯示,舒尼替尼組SW480細胞凋亡率較對照組均顯著升高,且隨著舒尼替尼濃度升高,同一時間點SW480細胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高,提示舒尼替尼具有抑制結腸癌細胞增殖、誘導凋亡的作用。

細胞增殖、凋亡過程與細胞周期失調密切相關,當細胞周期不受機體正常控制,并不斷進入新的循環時,會導致細胞無限增殖,這是導致癌細胞過度增殖的主要原因;當細胞被阻滯于某一周期時,可阻止細胞進入新一輪的細胞周期,進而抑制細胞增殖并誘導其凋亡[16]。本研究結果顯示,隨著舒尼替尼的處理濃度升高,SW480細胞G0/G1期比例均顯著升高,S期、G2/M期比例均顯著降低,提示舒尼替尼可能是一種細胞周期特異性藥物,能夠誘導SW480細胞阻滯于G0/G1期,并阻止細胞進入S期,從而抑制細胞增殖并誘導其凋亡。

Notch信號通路是腫瘤發生、發展過程中的重要通路,其直接參與結腸癌發生發展[17]。既往研究表明,Notch信號在多種腫瘤的增殖調控中發揮著重要而多樣的作用,可能存在潛在的調控機制[18-20]。梁璐等[1]和劉少瓊等[6]研究表明,黃芩苷、姜黃素均通過抑制Notch1信號通路誘導結腸癌SW480細胞株凋亡。Zhang等[18]研究表明,過度表達Notch4可抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲,同時誘導細胞凋亡。李淑靜等[12]研究表明,舒尼替尼通過抑制Notch1表達誘導人胰腺癌細胞凋亡過程。Notch信號可通過非經典信號通路調控多個下游分子,包括NDRG4、P53和Bax等。NDRG4是新型的腫瘤抑制因子,對腫瘤細胞的凋亡具有調控作用,是預測結直腸癌患者總體生存率的指標[21]。p53基因是目前基因研究中最深入、最廣泛的腫瘤基因,是調控細胞凋亡的關鍵分子之一[22]。Bax是B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族的促凋亡成員,可促進細胞凋亡[23]。本研究結果顯示,隨著舒尼替尼處理濃度升高,SW480細胞中Notch1蛋白表達水平顯著降低,Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達水平均顯著升高,提示舒尼替尼可能通過抑制Notch1蛋白表達,促進Notch4、P53、NDRG4、Bax表達,發揮抑制SW480細胞增殖并誘導其凋亡的作用,但具體調控機制還需進一步研究。

綜上所述,舒尼替尼可能通過抑制Notch1蛋白表達、促進Notch4蛋白表達進而調控下游分子信號通路,誘導結腸癌SW480細胞凋亡。