基于CRISPR/Cas9 技術快速構建PRV gE 基因缺失病毒

（內蒙古農業大學獸醫學院，農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018）

偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科，會導致成年母豬流產、產死胎以及仔豬中樞神經系統疾病，未免疫母豬產下的仔豬感染PRV 時，死亡率可達100%[1-2]。早在1947 年，我國首次從患貓體內檢測出PRV。1970 年后，PRV 在我國呈蔓延趨勢，直至從匈牙利引入Bartha-K61 株疫苗后，疫情才得到有效控制[3]。2011 年以來，PRV 在我國發生變異，使Bartha-K61 疫苗不能提供足夠的保護，導致偽狂犬病迅速流行，并席卷全國[4-7]，其中母豬患病率達35%以上，野毒感染豬群超過50%，對我國養豬業造成了巨大損失[8]。PRV 基因組編碼許多蛋白，其中gE 蛋白是主要的毒力因子。在PRV 變異株感染的豬群中，檢測發現gE基因抗體水平逐年上升。因此，gE基因缺失疫苗可以在降低病毒毒力的同時區分野毒感染和疫苗免疫[9]。我國最初引入的Bartha-K61 株就是gE基因缺失疫苗株。早在2000年，何啟蓋等[10]使用TK-/gG-/LacZ+突變株進行動物實驗，證實PRV 基因缺失毒株的安全范圍比親本毒株廣，具有很好的免疫原性。自2013 年以來，CRISPR/Cas9 技術作為強大的基因編輯技術[11]，已經在病毒基因編輯上獲得了廣泛應用，如：Van等[12]利用CRISPR/Cas9 技術成功編輯了HCMV和HSV-1；2018 年穆艷霞等[13]使用CRISPR/Cas9技術，利用先重組EGFP 標簽反向篩選的方法成功獲取了IBR-ΔgE病毒；湯艷東等[14]構建了螢光素酶標記基因、EGFP 基因雙標簽重組病毒，同時建立了PRV 大片段缺失平臺，證實了2 個sgRNA介導的大片段基因缺失效率更高。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技術與實驗室分離到的PRV 毒株，快速對其gE基因進行編輯，旨在為今后的PRV 基因編輯提供思路，也為后期應對PRV 變異株的基礎研究及防控提供一種候選方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞系 PRV-1 毒株，由內蒙古農業大學獸醫學院傳染病教研室分離、鑒定及保存；PK-15（豬腎細胞）、VERO（非洲綠猴腎細胞），由內蒙古農業大學傳染病教研室保存。

1.1.2 主要試劑及載體 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），DMEM 培養基，opti-MEM 以及EDTA-胰酶，購自Gibco 公司；BbsI 限制性核酸內切酶，購自NEB 公司；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 高保真酶、solution I，購自TaKaRa 公司；DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自Therom公司；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒，購自TIANGEN 公司；低熔點瓊脂糖，購自Sigma 公司；轉染試劑Lipofactamine 3 000，購自Thermo Fisher公司；大腸桿菌DH5ɑ 感受態細胞、Stbl 3 化學感受態細胞，購自北京全式金生物技術有限公司；pcDNA3.1載體、pSpCas9-2A-puro 和pSpCas9（BB）-2A-GFP 載體，由內蒙古農業大學傳染病教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PRVgE基因克隆測序 根據NCBI 上已公布的偽狂犬病毒（PRV）基因序列（登錄號KU056477.1），在primer premier 5.0 軟件上設計針對gE基因的上下游引物PRV-gE-F、PRV-gE-R（表1）；以本實驗室提取的PRV-1 基因組為模板，采用PCR 方法擴增gE基因。PCR 反應體系：ddH2O 15 μL、GXL buffer 5 μL、dNTP 2 μL 以及PRV-gE-F、PRV-gE-R 各1 μL，PRV-1 基因組0.75 μL，GXL DNA Polymerase 酶0.25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性120 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸120 s，35 個循環；68 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產物送華大基因有限公司測序。

1.2.2 野生病毒感染力測定 將PRV-1 病毒按照10-1～10-8進行10 倍倍比稀釋后，各吸取100 μL 病毒稀釋液，接種于長到80%左右的PK-15 細胞上，每組8 個重復，同時設置陰性對照。逐日觀察并記錄結果，5 d 后按照Reed-Muench 法進行TCID50測定。計算公式為：

表1 試驗所用引物及目的

將比距加在高于50%死亡稀釋度的對數上，即為0.1 mL 所含病毒液的稀釋度。

1.2.3 轉染細胞系篩選 首先將pSpCas9（BB）-2A-GFP 載體，利用脂質體轉染法（Lipofectamine?3 000），將PX459-1、PX459-2 和PX459-3 質粒分別轉染PK-15 細胞與VERO 細胞，48 h 后熒光顯微鏡（ZEISS、HAL100）下觀察，篩選轉染效率較高的細胞系。

1.2.4 CRISPR/Cas9 載體構建及篩選 按照1.2.1測序得到PRVgE基因序列，通過網站http://crispr.mit.edu/設計3 對分數較高且GC 含量約50%的gE-sgRNA，并合成其互補引物對（表1）；將互補的gE-sgRNA 引物gE-sgRNA1-F/gE-sgRNA1-R、gE-sgRNA2-F/gE-sgRNA2-R 和gE-sgRNA3-F/gEsgRNA3-R 進行95 ℃ 5 min 高溫變性，然后逐漸降溫至16 ℃，獲得3 條雙鏈sgRNA；以BbsI 雙酶切pSpCas9-2A-puro 載體，膠回收大的載體片段；將3 條雙鏈gE-sgRNA 連入pSpCas9-2A-puro 酶切回收的載體中，使用Solution I 16 ℃過夜連接，將連接產物轉化Stbl 3 感受態細胞，提取質粒，對測序結果使用snapgene 軟件分析，獲得CRISPR/Cas9 重組質粒PX459-1、PX459-2 和PX459-3。將構建好的PX459-1、PX459-2 和PX459-3 分別轉染VERO 細胞，12 h 后接種MOI=0.1 的PRV-1，感染48 h 后使用10%中性甲醛固定2 h，之后使用0.8%結晶紫染色0.5 h，沖洗干凈后觀察。

1.2.5 PRV-1-ΔgE構建 利用脂質體轉染法，將CRISPR/Cas9 載體PX459-1、PX459-2，按 照1:1 的比例轉染入VERO 細胞培養6 h，更換含2%FBS 的細胞維持液，培養至12 h 后接種MOI=0.1的PRV-1，待細胞病變至90%左右時收毒；將病毒反復凍融3 次，按照1:1 000 稀釋度稀釋感染6 孔板中的PK-15 細胞，病毒吸附2 h 后，使用DMEM（含2% FBS、1%低熔點瓊脂糖）覆蓋，置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養48 h；于超凈工作臺中使用槍頭隨機挑起10 個病毒蝕斑，分別置于200 μL DMEM 中，反復凍融3 次后接種生長至90%的PK-15 細胞。重復以上步驟，噬斑克隆純化5 代，然后將病毒接種于PK-15 細胞中擴大培養，提取病毒基因組，使用檢測引物seq-PRVgE-F/R 進行PCR 擴增檢測。PCR 體系與反應條件與1.2.1 中介紹相同。將測序結果使用MEGA 7 軟件進行對比分析，鑒定后擴大培養，-80 ℃保存。

1.2.6 PRV-1-ΔgE遺傳穩定性檢測 將PRV-1-ΔgE接種至PK-15 細胞，連續傳代至第20 代，并取第5、10、20 代缺失病毒DNA，使用PRV-gE-F和PRV-gE-R 進行PCR 擴增。PCR 產物送華大基因測序，并對測序結果進行比對。

2 結果與分析

2.1 PRV-1 gE 基因PCR 擴增

按照1.2.1 中PCR 體系獲得的gE基因測序結果為1 740 bp，與試驗預期一致（圖1）。

圖1 PRV gE 基因PCR 擴增結果

2.2 PRV 野毒感染力測定

野生病毒感染力測定如表2 所示。當病毒稀釋至10-6時，出現CPE 的細胞孔所占百分比高于50%，為76.9%，稀釋至10-7時，出現CPE 的細胞孔所占百分比低于50%，為36.4%。

將表2 所測得數據帶入1.2.2 中的公式，得到的比距約為0.7，加上高于50%感染的稀釋度對數（10-6），PRV-1 的TCID50為10-7.7/mL。

2.3 轉染細胞系篩選

通過熒光顯微鏡觀察，發現VERO 細胞轉染效率高于PK-15 細胞（圖2），因此本試驗選擇VERO 細胞作為轉染細胞系。

2.4 CRISPR/Cas9 質粒構建與篩選

根據snapgene 軟件分析結果，判定CRISPR/Cas9 質粒PX459-1、X459-2 和PX459-3 構建成功（圖3）。將PX459-1、X459-2 和PX459-3 質 粒轉染細胞篩選，發現sgRNA1 和sgRNA2 效率大于sgRNA3（圖4），因此選擇sgRNA1 和sgRNA2做后續試驗。

表2 病毒TCID50 測定結果

圖2 pSpCas9（BB）-2A-GFP 在PK-15 與VERO 細胞上的轉染效率（50×）

2.5 PRV-1-ΔgE 構建

圖3 sgRNA 構建測序結果

圖4 sgRNA 篩選結果

使用seq-PRV-gE-F/R 引物進行PCR 檢測，發現gE基因發生缺失（圖5）；將測序結果使用MEGA 7 軟件比對分析發現，PCR 產物大小為2 424 bp，與預期一致，PRV-1-ΔgE為2 132 bp，gE基因323～613 bp 位置缺失291 bp（圖6）。

圖5 PRV gE 基因檢測引物PCR 鑒定結果

圖6 PRV-1 與PRV-1-ΔgE 測序比對結果

2.6 PRV-1-ΔgE 遺傳穩定性檢測

將PRV-1-ΔgE連續傳代至20 代，分別取5、10、20 代病毒進行測序分析，發現沒有發生堿基突變現象。

3 討論

目前，針對PRV 感染還沒有系統有效的治療方法，因此疫苗接種是控制其流行和凈化的有效方法。自2011 年以來，PRV 不斷發生變異，至今依然在我國部分地區廣泛流行[15-16]，因此快速應對新發變異的PRV 就顯得尤為重要。這些基因的缺失會導致PRV 毒力降低，且不影響病毒的感染和復制能力。據相關資料[17-18]顯示，一些歐美國家通過基因缺失疫苗免疫，已經根除了PRV。PRV 基因工程疫苗研制通常選用缺失TK、gE、gI或gG等毒力基因[19-20]。

穆艷霞等[13]使用CRISPR/Cas9 技術編輯IBRV，在gE基因位置處重組EGFP 熒光標記，通過sgRNA 反向敲除EGFP 基因構建IBR-ΔgE病毒。吳鳳筍[21]使用傳統的同源重組結合Cre/loxp系統，先在gE、TK位置分別重組EGFP 標記基因，篩選攜帶熒光的PRV，后將標記基因分別切除構建了1 株PRV-ΔgE-ΔTK重組病毒。靶向基因編輯技術與傳統的同源重組技術相比較，它對基因組的修飾效率可以提高103～105倍[22]。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技術，僅通過單獨轉染1 對sgRNA，接種病毒誘導細胞內非同源末端修復即獲得PRV-1-ΔgE。相比較于傳統的同源重組技術，CRISPR/Cas9 技術大大提高了基因編輯篩選速度與效率。首先，在CRISPR/Cas9 技術當中，篩選轉染效率高的細胞系與獲得高效的sgRNA至關重要。因此，本試驗首先選擇了PK-15 細胞與VREO 細胞作為轉染細胞系，經過篩選發現VERO 細胞的轉染效率遠高于PK-15 細胞且可以被PRV 感染。本試驗結果與湯艷東[13]、穆艷霞[14]等細胞系篩選結果一致。其次，sgRNA 的工作效率及脫靶效率直接影響基因編輯的成功率。Cho 等[23]認為成對的Cas9 內切酶共同作用于目標基因組，會使脫靶效率明顯降低。在sgRNA 篩選中，本試驗首先設計了3 條sgRNA，經過噬斑形成試驗，篩選到2條可以高效切割病毒基因的sgRNA，最后在噬斑克隆過程中，因為沒有標簽，所以隨機篩選了10個單獨噬斑克隆。在這個過程中，要挑選相對于野生病毒噬斑稍小的噬斑克隆，突變毒株的噬斑會稍小于野生病毒[14]。同時，相比較于標簽反向篩選，本試驗沒有插入標簽，因而后期就省去了刪除標簽的步驟。

4 結論

綜上，本試驗采用CRISPR/Cas9 第3 代基因編輯技術，快速對PRV-1 進行編輯，確定了1對高效編輯PRVgE基因的sgRNA，并獲得1 株PRV-1-ΔgE。本研究提供了一種高效的PRV-1 毒株編輯方法，為后續構建多基因缺失病毒提供了基礎數據，也為快速應對PRV 變異及其相關變異株基礎研究提供了新思路。