大豆種質發芽期耐鹽堿性鑒定及指標篩選

張新草，薛項瀟，姜 深，王延峰，曹永策

(延安大學 生命科學學院，陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安 716000)

土壤鹽堿化不僅是一個全球性的生態問題，同時是干旱和半干旱地區限制植物種子萌發、植株生長和發育的一個重要因素。全世界約有10億hm2的土地表現出鹽堿化，中國各類鹽堿土地的面積為9 913萬hm2，約占全國耕地面積的10%[1-2]。尤其在中國西北地區，包括寧夏、新疆、陜西和甘肅等省常年降雨較少，水分蒸發量大，土壤鹽堿化嚴重。因此，鑒定和篩選適于鹽堿地生長的植物品種(系)，具有重大的生態和經濟意義。

大豆(Glycinemax)是人類主要的蛋白質和食用植物油來源，具有很高的營養價值[3-4]。中國作為世界上最大的大豆消費國，進口量逐年上升，增加國內大豆的總產量已刻不容緩[5]。充分利用中國大量的鹽堿土地資源，是增加大豆產量的一個有效途徑。因此鑒定不同大豆種質的耐鹽堿性，對于大豆耐鹽堿育種及增加大豆有效種植面積、提高大豆總產量具有重要的意義。雖然目前在大豆耐鹽堿種質資源發掘方面取得許多研究進展，但仍存在一些不足之處。一是有關大豆種質的耐鹽堿性鑒定側重在耐單一的中性鹽或堿性鹽脅迫上，耐混合鹽堿脅迫的研究較少，而混合鹽堿脅迫對植物造成的危害并不是鹽、堿脅迫危害的簡單疊加，其危害程度要遠大于單一的鹽或堿脅迫[6-7]；二是大豆種質耐鹽堿性的鑒定方法多種多樣，不同研究者鑒定所用的指標也不盡相同[8-10]。因此，建立一種操作簡單、指標明確的鑒定方法有重要意義。

種子發芽期是植株生長發育過程中的初始階段，發芽階段的耐鹽堿性對其能否在鹽堿地中存活與生長發育起到至關重要的作用[11-12]；且種子發芽期的一些形態指標(如發芽率、發芽勢、根長等)因測定方法簡單而被廣泛應用于評價種質耐鹽堿性的研究中[13-16]。為此，本試驗利用18份特異的大豆種質資源，在種子發芽階段進行混合鹽堿脅迫處理，利用主成分分析、隸屬函數和多元回歸等統計方法對各種質的不同指標進行分析，旨在篩選出優異耐鹽堿材料與重要的大豆耐鹽堿性評價指標，為大豆耐鹽堿育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

共選取18份大豆特異種質為試驗材料(表1)。

表1 供試大豆品種(系)Table 1 Tested soybean cultivars (lines)

1.2 試驗設計

釆用人工氣候箱對供試的18份大豆種質進行培養，條件為光照/黑暗時間15 h/9 h，溫度為28 ℃/24 ℃。挑選大小一致、子粒飽滿的種子，用75%酒精消毒30 s，然后用去離子水沖洗(3～5次)干凈，將種子表面水分吸干，放置于事先鋪好濾紙的培養皿中(直徑9 cm)，每培養皿20粒。每個培養皿加入12 mL的60 mmol/L(預試驗篩選出的脅迫濃度)混合鹽堿(NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 9∶1∶1∶9，物質的量之比)溶液，并在種子的上表面覆蓋一張濾紙，每2 d更換1次培養皿內的溶液和濾紙。以蒸餾水為對照，每個處理設置3個重復。自培養第2天起，以幼苗根長度大于或等于種子長度的一半作為發芽標準，每天統計發芽數，并在處理6 d后測定其他形態指標。

1.3 指標測定

種子培養3 d后考察發芽勢，培養6 d后考察發芽率，并取發芽狀況較好且均勻一致的3株幼苗測量幼苗長、根長、苗鮮質量、根鮮質量和根干質量。其中：

發芽勢=3 d發芽種子數/供試種子數×100%

發芽率=6 d發芽種子數/供試種子數×100%

1.4 數據統計與分析

使用SPSS 21和Excel 2016數據統計分析軟件對各指標值進行描述性統計和指標間的相關性分析；利用主成分分析、隸屬函數和多元回歸等方法對供試材料的耐混合鹽堿性進行鑒定和級別歸組，并篩選耐鹽堿性的主要評價指標。

首先計算各個種質在各個指標上耐鹽堿性測度——耐鹽堿系數(Saline-alkali tolerance coefficient,SATC)：

SATCij=yij(SA)ij(CK)

其中：yij(SA)和ij(CK)分別為混合鹽堿脅迫和對照條件下不同種質i(i=1,2,…,18 )在j(j=1,2,…,7)指標上觀測值的平均數。

根據各指標耐鹽堿系數，分析指標間相關性。分析不同耐鹽堿系數間可能存在的信息交叉和重疊。

對所有耐鹽堿系數進行主成分分析，以對變量進行降維。并提取累積貢獻率大于85%的前P個主成分(綜合指標)替代原來的耐鹽堿系數用于大豆耐鹽堿性評價。

計算不同材料在前P個主成分上的值，并利用隸屬函數法將這些值進行標準化處理(標度到區間[0，1])。

μ(FiP)=(FiP-min(FP))/(max(FP)-min(FP))

式中：μ(FiP)表示種質i(i=1,2,…,18 )在第P個主成分(綜合指標)上標準化處理后的值；FiP表示第i個種質在第P個主成分上的值；max(FP)和min(FP)分別為所有種質在第P個主成分上的最大值和最小值[17-19]。

根據主成分貢獻率的大小，求出各個綜合指標的權重。

式中：ωP表示第P個綜合指標在所有綜合指標中的權重，φP為第P個綜合指標的貢獻率。

根據綜合指標在不同材料中的隸屬函數值和各綜合指標的權重，計算出18份材料耐鹽堿性的綜合評價值(D值)(即所有材料在各個主成分上的標準化得分的加權平均數)。

以綜合D值對18份材料的耐鹽堿性進行分類。標準為:(0-0.2]，極端敏鹽堿；(0.2-0.4]，敏鹽堿；(0.4-0.6]，中等；(0.6-0.8]，耐鹽堿；(0.8-1.0]，極端耐鹽堿。

最后以綜合D值為因變量，各指標耐鹽堿系數為自變量進行回歸分析，建立回歸方程。篩選出快速評價大豆種質發芽期耐鹽堿性的形態指標。

2 結果與分析

2.1 發芽期指標

在60 mmol/L混合鹽堿脅迫下，18份特異種質的發芽勢、發芽率、幼苗長、根長、苗鮮質量、根鮮質量和根干質量的均值相較于對照組分別降低了132.9%、121.1%、97.9%、158.0%、 32.1%、161.8%和330.1%(表2)。表明混合鹽堿脅迫對調查的各個指標均有負向效應，能夠抑制種子發芽和幼苗的早期生長。

2.2 各單項指標的耐鹽堿系數及相關性分析

由表3可知，在混合鹽堿處理下，不同大豆種質的各單項指標與對照相比均有所下降，各指標的耐鹽堿系數均小于1，但不同指標在種質間的變化幅度和排列順序不同。由此可見，使用單個指標評價大豆種質的耐鹽堿性，結果通常具有局限性，不夠準確。

由表4可知，大豆發芽期各指標的耐鹽堿系數間存在不同程度的相關性。其中，相對幼苗長與相對根長、相對幼苗長與相對苗鮮質量、相對幼苗長與相對根鮮質量、相對根長與相對苗鮮質量、相對根長與相對根鮮質量、相對苗鮮質量與相對根鮮質量、相對發芽勢與相對發芽率之間存在極顯著相關性(P<0.01)；相對根鮮質量與相對發芽勢之間存在顯著相關性(P<0.05)。各指標耐鹽堿系數的相關性體現了這些指標間的內在聯系，研究結果反映出不同指標所提供的信息存在著嚴重交叉與重疊，因此有必要對指標進行降維分析。

表2 不同處理下大豆種質發芽期各指標值的統計分析Table 2 Statisticalanalysis of indicators under different treatments of soybean at germination stage

注：SD=標準差。

Notes:SD= standard deviation.

表3 各單項指標的耐鹽堿系數Table 3 Mixed saline-alkali tolerance coefficient of each indicator

表4 耐鹽堿系數的相關性分析Table 4 Correlation analysis of mixed saline-alkali tolerance coefficients

注：*P<0.05；**P<0.01。

Notes：*P<0.05; **P<0.01.

2.3 耐鹽堿系數的主成分分析

對大豆發芽期的幼苗長、根長、苗鮮質量、根鮮質量、根干質量、發芽勢和發芽率7個指標的耐鹽堿系數進行主成分分析。結果表明，上述7個單項耐鹽堿系數可以轉化為3個相互獨立的綜合指標(F1、F2和F3)。3個綜合指標的貢獻率分別為57.016%、19.881%和12.537%，累積貢獻率達89.434%，表明這3個綜合指標幾乎反映了原來7個指標所代表的全部信息(表5)。

表5 主成分的特征值和累計貢獻率Table 5 Eigenvalues and cumulative contribution of principal component

2.4 大豆發芽期耐鹽堿性的綜合評價

由F1、F2和F33個綜合指標貢獻率計算出各指標的權重，可知各主成分的相對重要性。結果顯示3個綜合指標的權重分別為0.638、0.222和0.140。根據各綜合指標在不同材料中隸屬函數值和指標權重的大小，計算出不同大豆種質的耐鹽堿性綜合評價值(D值)。結果表明，18份種質的D值為0.150到0.870，C10的D值最大，表明其耐鹽堿性最強；C14的D值較小，表明其對鹽堿最為敏感(表6)。最終將18份大豆種質的耐鹽堿性劃分為5類，其中極端耐鹽堿和極端鹽堿敏感的材料份數相同，均為2份，分別占總數的11.1%；中等耐鹽堿的材料最多，為9份，占 總數的50.0%；耐鹽堿的材料共3份，占總數 的16.7%；敏鹽堿的材料共2份，占總數的 11.1%。

表6 各大豆種質發芽期耐鹽堿性的綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation of saline-alkali tolerance of each soybean germplasm at germination stage

2.5 回歸模型建立及鑒定指標篩選

為分析7個指標與大豆品種之間的耐鹽堿性關系，篩選出能夠客觀鑒定大豆發芽期耐鹽堿性的指標，建立可用于大豆發芽期耐鹽堿性評價的數學模型。將耐鹽堿性綜合評價值(D值)作為因變量，把7個單項指標的耐鹽堿性系數作為自變量進行逐步回歸分析，建立回歸方程:

D=-0.365+0.808X7+0.772X1+ 0.364X4

方程決定系數R2=0.994，P<0.001，式中X1、X4和X7分別代表幼苗長、根鮮質量和發芽率的耐鹽堿系數。由此方程可知，7個參評指標中發芽率、幼苗長和根鮮質量3個指標對大豆耐鹽堿性有顯著性影響，在相同條件下可作為快速評價大豆種質耐鹽堿性的重要指標。

3 結論與討論

本研究基于不同指標的耐鹽堿系數，利用相關性分析、主成分分析和和耐逆性綜合評價D值等分析方法對18份大豆種質耐鹽堿性進行評價。根據D值的大小將18份種質的耐鹽堿性劃分為5類，其中極端耐鹽堿材料2份，分別是‘隴中黃606’和‘延豆9號’；耐鹽堿材料3份，‘冀豆1708’‘晉黃10號’和‘魯LH678’；中等耐鹽堿材料9份，分別是‘寧黃29’‘泛豆G98’‘陜豆3號’‘晉科6號’‘秦豆8號’‘陜豆7號’‘中黃30’‘中品16456’和‘中作J16J270’；敏鹽堿材料2份，分別是‘電白黑豆’和‘汾豆105’；極端鹽堿敏感材料2份，分別是‘邯豆16’和‘石335’。研究結果可為大豆耐鹽堿育種及鹽堿地開發利用提供材料基礎。同時本研究構建了耐鹽堿性評價的回歸方程，篩選出發芽率、幼苗長和根鮮質量3個指標可作為快速評價大豆種質發芽期耐鹽堿性的重要指標。在相同逆境條件下，也可測定這3個指標，利用該回歸方程快速預測其他種質的耐鹽堿性，為大豆種質耐鹽堿性鑒定及耐逆育種提供重要的 信息。

鹽堿地常可分為鹽地、堿地或含多種鹽堿成分的混合鹽堿地[20]。以往有關大豆種質耐鹽堿性的鑒定研究多是基于單一的中性鹽(NaCl等)或堿性鹽(Na2CO3等)[8,10,12,21-22]，但前人研究結果表明，混合鹽堿脅迫對植物造成的危害程度要遠大于單純中性鹽或堿性鹽脅迫[23-24]。因此只采用單一的中性鹽或堿性鹽進行脅迫試驗，得到的結果對于分析大豆耐鹽堿機制以及指導耐鹽堿改良育種均具有一定的局限性。尤其在中國西北干旱半干旱區，土壤鹽堿化嚴重，且鹽化與堿化往往相伴發生，土壤成分中既有堿性鹽，又有中性鹽[25]。其中，氯化鹽和碳酸氫鹽是西北地區兩種重要的鹽堿成分[26]。因此本研究以NaCl和Na2CO3兩種鹽為主、Na2SO4和NaHCO3兩種鹽為輔混合配置混合鹽堿溶液，用來模擬復雜的鹽堿脅迫環境，相對單一的中性鹽或堿性鹽來講，更能真實地反映田間鹽堿脅迫的實際情況。

大豆種質的耐鹽堿性是一個復雜性狀，有時單一指標并不能全面評價其耐鹽堿性。但對復雜性狀使用多個指標進行評價時，又會因為性狀間的相關性造成評價不準確[8，13,27-28]。本研究結果也顯示了多個指標的耐鹽堿系數間存在極顯著或顯著的相關性，且不同單項指標的耐鹽堿系數在不同種質中的大小排序也有所不同，表明利用單個或多個相關的單項指標對大豆種質的耐鹽堿性進行評價均具有一定局限性。因此本研究基于不同指標的耐鹽堿系數，利用主成分分析和耐逆性綜合評價等分析方法對18份大豆種質耐鹽堿性進行了評價。在數據處理與耐性評價過程中，既降低了指標間代表信息的交叉與重疊，同時也考慮了綜合指標重要性的差異，更有助于客觀的評價大豆種質的耐鹽堿性。并且本研究通過回歸分析構建的大豆種質發芽期耐鹽堿性的評價模型和篩選出的重要評價指標，在相同條件下也能夠為快速預測其他種質的耐鹽堿性提供依據。但在本試驗中，僅對18份大豆種質發芽期耐鹽堿脅迫進行了相關的試驗，對種質的耐鹽性和耐堿性及在其他生育期的耐鹽堿性仍有待在后續工作中繼續研究。