FAD 為輔基的葡萄糖脫氫酶發酵、純化及酶學性質

林 榮， 宋祖坤， 張 玲， 王 男， 楊海麟

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

血糖水平是糖尿病臨床診斷的主要和常規檢測指標[1]。 葡萄糖氧化酶是葡萄糖檢測試劑盒或葡萄糖傳感器中應用最廣泛的原料用酶，但其催化活性易受溶解氧的限制，會造成測量誤差。 目前發現葡萄糖脫氫酶具有替代葡萄糖氧化酶的潛力，因其不以氧氣為電子受體，不受溶解氧的限制，檢測結果誤差更小[2]。

葡萄糖脫氫酶按照輔基或輔酶類型可分為4類[3]： 1）以NADP+為輔酶的葡萄糖六磷酸脫氫酶（EC1.1.1.49 簡稱G6PDH）； 2）以NAD+為輔酶的葡萄糖脫氫酶 （EC 1.1.1.47 簡稱NAD-GDH）； 3）以PQQ 為輔基的葡萄糖脫氫酶（EC1.1.5.2 簡稱PQQGDH）；4）以FAD 為輔基的葡萄糖脫氫酶（EC1.1.99.10簡稱FAD-GDH）。 G6PDH 和NAD-GDH 輔因子結合不緊密，催化過程中需要不斷添加輔酶[4-5]。 PQQGDH 熱穩定性差，底物譜較廣[6]，除葡萄糖外還能以多種單糖和二糖為底物， 限制其檢測血糖的應用。FAD-GDH 具有熱穩定性好、催化效率高、輔基結合緊密等優勢，可作為替代目前診斷用葡萄糖氧化酶的首選。

FAD-GDH 主要來源于真菌[7]，罕見于細菌。 真菌分泌FAD-GDH 較少，研究者主要研究其基因在Pichia pastoris和E.coliBL21 中的異源表達。楊愈峰等人將來源于土曲霉的FAD-GDH 基因在Pichia pastoris中進行表達， 通過表達篩選及15 L 發酵罐發酵，上清液酶活達2.6×105U/L[8]，但在酵母菌中表達的異源葡萄糖脫氫酶存在糖基化修飾，會干擾血糖檢測電極的靈敏度，實際生產應用中需進行酶的去糖基化步驟[9]。 周立偉等人篩選克隆出來源于青霉的FAD-GDH 基因，在E.coliBL21 中表達的蛋白質大部分為包涵體[10]。 來源于真菌的葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中異源表達常常需要與分子伴侶共表達才能實現可溶性表達，蛋白質純化和放大生產較為困難。Koji Sode 等人發現并克隆了迄今惟一來源于細菌Burkholderia cepacia的FAD-GDH 基因，并研究了分子伴侶對酶表達的影響[11]，但并未對其異源表達發酵生產、純化和酶學性質做全面和深入研究。

作者將來源于Burkholderia cepacia的以FAD為輔基的葡萄糖脫氫酶基因[12]在E.coliBL21（DE3）中進行表達，選用工業生產上廉價的乳糖作為誘導劑，7.5 L 發酵罐放大培養，探索分離純化工藝，研究其酶學特性，為其工業化生產及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 重 組E.coliBL21 （DE3）/pTrc99a-GDH：由作者所在實驗室構建。

1.1.2 培養基 LB（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉5，加入2 g/dL 的瓊脂為LB 固體培養基。

發酵培養基（g/L）：酵母膏10，蛋白胨15，葡萄糖0.5， 甘油5 mL/L， 無機鹽成分Na2HPO27.1，KH2PO42，K2HPO44，（NH4）2SO41.3，MgSO40.12，微量元素[11]。 培養基均添加過濾除菌的氨芐青霉素100 mg/L。

補料培養基（g/L）：酵母膏50，蛋白胨50，甘油100 mL。

乳糖誘導液（g/L）：乳糖200。

1.1.3 緩沖液 50 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH 4.0），50 mmol/L 醋酸緩沖液（pH 5.0），50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 6.0～7.0），50 mmol/L Tris-HCl 沖液（pH 8.0～9.0）。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 種子液的制備：從平板挑取單菌落接種到LB 培養基，于37 ℃、200 r/min 搖床培養8 h。

7.5 L 罐發酵：7.5 L 發酵罐中加入4 L 培養基，115 ℃滅菌30 min，將活化的種子液按體積分數5%接入發酵罐分批培養，溶氧迅速上升，恒速0.04 L/h流加補料培養基10 h， 溫度從37 ℃降到30 ℃，恒速0.015 L/h 流加乳糖誘導表達。 pH 通過自動流加50%的磷酸和25%的氨水控制在7.0，通過攪拌轉速及通氣量調節溶氧維持在30%[13]。

1.2.2 菌體生物量測定 取不同OD600的適量菌液，8 000 r/min 離心10 min 清洗兩次，105 ℃烘干至恒定值，稱取細菌干重，細胞干重與OD600成線性y=0.44x-0.036。

1.2.3 酶的分離純化 8 000 r/min 離心5 min 收集菌體后，用pH 7.0、50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，破壁后8 000 r/min 離心10 min，上清液即為粗酶液。 利用融合在酶C 末端的組氨酸標簽，將粗酶液分別過HisTrap HP（鎳柱）、HiPre TM 26/10 Desalting（脫鹽柱）和DEAE FF（陰離子交換柱層析柱），獲得純酶。

1.2.4 酶活測定 酶活定義：在一定條件下，每分鐘還原1 μmol 2，6-二氯靛酚鈉所需的酶量定義為一個酶活單位。

以葡萄糖為底物，取100 μL 適當稀釋的酶液，加入3 mL 顯色液（50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液，pH 7.0，0.03 mmol/L 的2，6-二氯靛酚鈉，1.6 mmol/L 的吩嗪硫酸甲酯，100 mmol/L 的葡萄糖溶液） 輕輕混勻，用重蒸水調零，37 ℃每隔1 分鐘記錄600 nm 處吸光值的變化，共記錄2～3 min[7]。

比酶活為每毫克蛋白質具有的酶活力。 蛋白質質量濃度用考馬斯亮藍法測定[14]。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE 凝膠電泳采用5 g/dL 的濃縮膠與12 g/dL 的分離膠， 電泳緩沖液為pH 8.3 的Tris-Gly 緩沖液， 當用電壓80 V 跑過濃縮膠，調節電壓至100 V，電泳后用考馬斯亮藍染色。 膠的具體配置操作方法參照SDS-PAGE試劑盒。

1.2.6 等電聚焦凝膠電泳 將蛋白質樣品加入到加樣紙上， 將加樣紙排放在電極間的凝膠中央，恒壓60 V 電泳15 min，8 mA 恒流至電壓升至550 V，關閉電源，揭去加樣紙，然后恒壓550 V 電泳3 h，等電流降至接近零，停止電泳。 將膠在固定液中浸泡40 min，除去兩性電解質（降低考馬斯亮藍對兩性電解質的染色），用蒸餾水漂洗一次，然后用染色工作液染色。 膠使用GE 的預制膠。

1.2.7 葡萄糖脫氫酶酶學性質分析 將純化得到的酶液取200 μL 進行300~500 nm 范圍的全波長掃描， 再加入20 μL、1 mol/L 葡萄糖溶液反應5 min，再進行全波長掃描。

酶對不同糖類的催化差異： 分別選擇葡萄糖、麥芽糖、木糖、半乳糖、海藻糖、果糖、山梨醇、蔗糖作為底物，加入0.1 U/mL 的酶液100 μL，以葡萄糖為底物測得的酶活為100%， 計算其它底物的相對酶活。

酶動力學參數測定：配置0.2～4 mmol/L 不同濃度的葡萄糖、麥芽糖、木糖溶液為底物，測定不同底物濃度下酶的活力，計算相應的反應速度。 用雙倒數作圖法（Lineweaver-Burk）作圖，以1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標，求得Km與kcat。

最適反應pH：在pH 5.0～9.0 條件下，于37 ℃測定酶活， 以酶活最高者為100%， 計算其相對活性，確定最適反應pH。

pH 穩定性： 將純酶置于pH 5.0～9.0 不同緩沖液中，25 ℃下放置16 h，測定其剩余酶活力。

最適反應溫度：以葡萄糖為底物，在pH 7.0 緩沖液中， 于不同溫度（30、37、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃）測定酶活，以酶活最高者為100%，計算其相對酶活，確定其最適反應溫度。

溫度穩定性：以葡萄糖為底物，在pH 7.0 緩沖液中，于不同溫度（30、37、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃）放置30 min 后，測定殘余酶活。

2 結果與分析

2.1 7.5 L 罐發酵培養

相比真菌來源的FAD-GDH 在E.coli中可溶性表達困難，常常需要與分子伴侶系統共表達，細菌來源的外源基因在E.coli可實現可溶性表達， 且產量可進一步通過發酵優化提升。

IPTG 由于價格昂貴且存在潛在的化學毒性，限制了其在工業上的應用。 乳糖作為天然的誘導劑無污染， 價格便宜， 誘導強度相比IPTG 較小，可以減少包涵體產生，同時作為碳源還能促進菌體生長[13-14]。 作者選取乳糖作為誘導劑， 通過分批補料提高菌體濃度，再通過分階段溫度控制促進蛋白質表達[15]。

圖1 為7.5 L 發酵罐培養。 發酵過程分為3 個階段：第一階段初始的營養物質大約在10 h 左右消耗完，此時溶氧上升。 第二階段的補料開始，恒速0.04 L/h 流加補料培養基。在這一階段400 mL 補料培養基大約10 h 內被消耗。將溫度調到30 ℃，恒速0.015 L/h 流加乳糖誘導開始第三階段，乳糖終質量濃度10 g/L。 酶活達到1 341 U/L，菌體量達12.4 g/L。

圖1 7.5 L 罐發酵培養Fig. 1 7.5 L tank fermentation culture

2.2 酶的分離純化

通過鎳柱、脫鹽柱、陰離子交換柱三步層析對粗酶液進行分離純化。

重組酶的C 末端帶有組氨酸標簽， 見圖2（a）。先經過鎳柱純化，去掉絕大多數的雜蛋白質，對目的蛋白質起到很好的濃縮效果，將這一步得到的酶液過脫鹽柱去除多余的鹽離子， 見圖2 （b）。 再經DEAE 陰離子交換柱，見圖2（c）。 紫外吸收峰較為明顯，通過三步層析，獲得純化倍數為40、總回收率為40%的酶，分離純化結果見表1。利用SDS-PAGE檢驗最終所得的蛋白質純度，圖2（d）顯示最終樣品呈現單一條帶，說明該酶達到電泳純。

DEAE 純化時要求酶緩沖液的pH 高于酶的等電點，同時要求緩沖液鹽離子濃度較低。 DNAMAN軟件預測FAD-GDH 的等電點為6.71。 鎳柱層析時使用的是pH 7.0 的磷酸鉀緩沖液，經過脫鹽柱層析緩沖液置換成pH 8.2 的Tris 緩沖液。DEAE 高鹽洗脫及較高的緩沖液pH 條件可能抑制部分酶活性，這可能是造成該酶經過DEAE 純化后比酶活及純化倍數沒有很大提升的原因。

圖2 FAD-GDH AKTA avant 層析圖譜及重組蛋白質純化的SDS-PAGE 鑒定Fig. 2 Chromatogram of FAD-GDH by AKTA avant and SDS-PAGE analysis on purified protein

表1 蛋白質的純化Table 1 Purification of protein

2.3 輔基FAD 的檢測

全波長掃描結果見圖3。 可以看出，FAD-GDH溶液在385 nm 和454 nm 左右有2 個特征吸收峰（實線），是由酶的FAD 輔基造成的，當加入足量的底物葡萄糖溶液，FAD 被還原成FADH2， 吸收峰消失（虛線），這些結果證明該葡萄糖脫氫酶的輔基是FAD。重組酶的氨基酸序列中含有一段FAD 結合位點的甘氨酸保守序列（GXGXXG），由此推測FAD 與酶非共價鍵結合。

圖3 全波長掃描FAD-GDH 酶液Fig. 3 Whole-weight screen of FAD-GDH solution

2.4 酶學性質研究

2.4.1 酶的等電點 等電聚焦電泳見圖4。 結果顯示酶的等電點5.3，DNAMAN 軟件預測的等電點為6.71，表明該酶的等電點偏酸性。對等電點的精確測量有助于提高分離純化的效率及酶的穩定性。

圖4 等電聚焦電泳圖Fig. 4 Isoelectric focusing electrophoresis pattern

2.4.2 酶對不同底物的催化差異 為了研究酶對不同底物的催化差異，測定了酶對不同底物相對酶活及動力學參數。

對異源表達的FAD-GDH， 以不同糖類為底物測定相對酶活，結果見表2。除對葡萄糖外僅對麥芽糖具有較高的催化活性，可能是由于麥芽糖由兩分子葡萄糖中間以α-1，6 糖苷鍵連接，水解產物為葡萄糖，對其他糖的催化活性較低，對果糖、山梨醇、蔗糖沒有催化活性， 較好的葡萄糖催化特性使得FAD-GDH 有較好的工業化應用前景。

表2 FAD-GDH 對不同糖類的催化差異Table 2 Catalytic differences by FAD- GDH to different sugars

Km是酶的一個特征常數， 在一定反應條件下Km的大小與酶的濃度無關，只與酶的性質有關。 使用稀釋成不同濃度的不同糖為底物進行酶活測定，得到的雙倒數曲線見圖5 和表3。 以葡萄糖為底物時，經米氏方程計算得到Km為2.56 mmol/L，相比麥芽糖和木糖，半乳糖的Km最小，其對葡萄糖的親和力最高。 以葡萄糖為底物時，最大反應速度Vmax為500 mmol/（L·s），kcat/Km為3 487.7 L/（mmol·s）。

圖5 FAD- GDH 催化不同糖的Lineweaver-Burk 關系Fig. 5 Lineweaver-Burk graph of FAD-GDH catalyze different sugars

表3 以不同糖為底物FAD-GDH 動力學參數Table 3 FAD-GDH kinetic parameters with different sugars as substrate

圖6 酶的pH 穩定性及最適反應pHFig. 6 pH stability of the enzyme and the optimum reaction pH

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2.4.3 酶pH 穩定性 反應體系的pH 會影響酶構象的穩定性，也會影響酶活性中心必需基團及底物的解離狀態，進而影響酶的催化效果。 由圖6 可知，酶的最適反應pH 為7.0， 重組酶在pH 為5.5～8.0時，具有較好的穩定性。 當pH 大于8.0 時酶活力迅速下降。 2.2 中蛋白質純化過程中DEAE 陰離子交換層析使用的是pH 8.2 的Tris 緩沖液，過堿的條件可能抑制了酶的活性，所以純化后比酶活及純化倍數沒有很大提升。

2.4.4 酶溫度穩定性 溫度升高導致溶液的擴散作用加劇， 一定程度上促使底物與酶分子的碰撞，使得反應速率加快。 溫度的上升也會改變酶分子的構象，從而影響酶的催化效率。 溫度過高使酶分子的結構被破壞，最終失去催化活性。 圖7 顯示，酶的最適反應溫度在70 ℃，55 ℃以內穩定。 同時通過DSC 測定該酶的Tm值為77 ℃，該重組酶的熱穩定性較好。

圖7 酶的溫度穩定性及最適反應溫度Fig. 7 Temperature stability of the enzyme and the optimum reaction

3 結 語

作者利用乳糖誘導改善來源于Burkholderia cepacia葡萄糖脫氫酶表達水平，利用乳糖作為誘導劑在7.5 L 發酵罐放大，通過分批補料、分階段溫度控制，酶活達到1 341 U/L，菌體量達12.4 g/L。 酶活及菌體量可通過發酵優化進一步提升。

將重組菌破碎得到的粗酶液利用鎳柱、 脫鹽柱、陰離子交換柱三步層析，最終獲得純化倍數40、比酶活109 U/mg 的酶， 這一系列方法達到較好的純化效果。 SDS-PAGE 凝膠電泳顯示，重組蛋白質純化后達到電泳純，相對分子質量約60 000，與理論值相符。 等電聚焦電泳顯示，該酶的等電點為5.3，與DNAMAN 軟件預測的6.71 相比更加精確。 酶標儀全波長掃描吸收光譜表明， 該酶的輔基為FAD，通過保守位點（GXGXXG）推測輔基與酶非共價鍵結合。

酶學性質研究發現，該酶對葡萄糖的親和力最高，Km為2.56 mmol/L，與報道的2.8 mmol/L[18]有所差異， 可能是因為文獻中所用的表達宿主為E.coliDH5α，質粒為pUC18，與本研究中存在差異。 最大反應速度Vmax為500 mmol/（L·s），kcat/Km為3 487.7 L/（mmol·s）。 在pH 5.5～8.0 內穩定，最適反應pH 在7.0， 當pH 大于8.0 時酶活力迅速下降，55 ℃穩定，差式掃描量熱分析（DSC）測得Tm值為77 ℃。

上述研究表明，該酶穩定性較好，催化效率高且不存在糖基化修飾， 適用于高靈敏度電極的開發，該細菌源葡萄糖脫氫酶具有替代市場上葡萄糖氧化酶的潛力。 本研究為該酶的進一步工業化應用提供參考與借鑒。