基于熒光分子開關(guān)和核酸適配體的鎘離子快速檢測方法

涂東堃 - 魯 悅 鄭曉亮 - 黃敏麗 - 王奕婧 - 曾紹校,2,3 -,2,3 徐 暉,2,3 ,2,3

(1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建省特種淀粉品質(zhì)科學與加工技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350002)

鎘是一種有毒的重金屬元素，長期暴露在鎘污染的環(huán)境中會對人的腎臟、肺、骨骼造成損傷，嚴重的還會致癌[1-3]。中國鎘離子在環(huán)境、糧食乃至食品的污染情況也不容樂觀，Wei等[4]對北京人口密度高的交通區(qū)、居民區(qū)的街道粉塵進行采樣，測定結(jié)果表明鎘的含量處于重度污染。陸素芬等[5]研究了南丹縣糧食作物玉米中重金屬離子的含量，結(jié)果表明鎘離子的超標率為8.4%，在鎘的影響下玉米中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪含量均會發(fā)生變化。李穎等[6]對邯鄲市某冶煉廠周邊的小麥進行檢測，結(jié)果表明小麥中鎘離子和鉛離子的含量均有超標的情況。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已將鎘離子分類為第一類致癌物質(zhì)[7]，中國生活飲用水衛(wèi)生標準中規(guī)定飲用水中鎘的限量標準為5 ng/kg，食品污染物限量標準中大米中鎘的限量標準為0.2 mg/kg。綜合以上原因，對環(huán)境和食品中的鎘離子進行監(jiān)測和控制具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的鎘離子檢測方法有原子吸收光譜法[8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜分析[10]、原子熒光光譜法[11]。這些檢測方法是相對較為成熟的方法，能夠?qū)Νh(huán)境中的鎘離子進行有效的分析，靈敏度、準確性、選擇性都比較好，但這些方法一般都要求有大型的儀器設(shè)備，專業(yè)的操作人員，檢測成本高，檢測過程繁瑣。

近些年，許多學者對環(huán)境和食品中重金屬殘留快速檢測技術(shù)進行了研究，其中主要有電化學法[12]、比色法[13]、試紙條方法[14]等。Si等[12]研制了一種基于還原氧化石墨烯(rGO)/金納米顆粒(AuNPs)/四苯基卟啉(TPP)(rGO/AuNPs/TPP)納米共軛物的電化學傳感器，通過TPP對Cd2+的選擇性富集，以及rGO對Cd2+與卟啉衍生物配位作用的加強，對鎘離子進行定量檢測。Guo等[13]利用Cd2+與四分子的谷胱甘肽(GSH)形成球形復合物的原理，研制出了一種基于GSH保護的納米金比色傳感器，并對水樣和消化后的大米樣品中的Cd2+進行檢測。Xiao等[14]研制了一種基于金納米星和量子點的集成免疫層析試紙條，對Cd2+進行檢測，檢測線達到0.18 ng/mL，線性范圍為0.25～8.00 ng/mL。這些方法具有方便、簡單、快捷等特點，但部分方法準確性和穩(wěn)定性較差，需要對其進行優(yōu)化和改進。

核酸適配體是能夠特異性識別靶標分子具有較高親和力的一類RNA或DNA分子，其識別靶分子的機理與抗原抗體相似，具有穩(wěn)定性好、易于合成和修飾等優(yōu)點[15]。近年發(fā)展起來的基于核酸適配體的檢測方法食源性致病菌、生物毒素、重金屬、藥物殘留檢測等領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景[16]。Bayramoglu等[17]通過磁捕獲和基于適配體的親和力對牛奶樣品中沙門氏菌的病原體細胞進行快速檢測，在沒有任何培養(yǎng)的情況下，在低至103CFU/mL的牛奶樣品中實現(xiàn)了沙門氏菌的檢測。核酸適配體能對一些小分子物質(zhì)進行識別，如重金屬等。Wu等[18]通過固定寡核苷酸鏈庫，建立了一種新方法進而篩選出了鎘離子核酸適配體。目前，用該核酸適配體對鎘離子進行檢測的研究比較少[19]。

噻唑橙(TO)是一種不對稱的花菁類陽離子染料，用作熒光檢測時可消除染料自身的背景干擾，提高熒光檢測靈敏度，是一種流行的核酸熒光探針，廣泛運用于檢測不同的DNA和RNA結(jié)構(gòu)[20]。Kang等[21]研制了一種基于噻唑橙和i-motif DNA構(gòu)象改變的傳感器，用于檢測Ag+。

試驗擬基于鎘離子核酸適配體和噻唑橙染料構(gòu)建一種鎘離子檢測的熒光方法，以期為核酸適配體在鎘離子快速檢測應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

噻唑橙：90%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

二甲基亞砜：頂空氣相色譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司；

乙醇、CdCl2·H2O、FeCl3·H2O、BaCl2·H2O、CaCl2等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

HEPES：1 mol/L，北京索萊寶生物科技有限公司；

磷酸鹽緩沖溶液：1 mol/L，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

超純水：18.2 mΩ，由Millipore凈水系統(tǒng)制備；

鎘離子適配體：5’-GGACTGTTGTGGTATTATTTTTGGTTGTGC-SH-3’，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：SQP型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

渦旋振蕩器：MS 3 basic型，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；

pH計：ST3100型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

超純水機：UV 24型，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；

冷凍離心機：UNIVERSAL 320R型，德國Hettich科學儀器公司；

超聲波清洗機：KQ5200E型，昆山舒美超聲儀器有限公司；

熒光分光光度計：RF-5301PC型，日本島津公司；

石墨爐原子吸收分光光度計：AA-6300C型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 鎘離子熒光檢測 在EP管中加入35 μL的100 mmol/L HEPES溶液，同時加入25 μL 2 μmol/L的核酸適配體，再加入鎘離子標準溶液，控制反應(yīng)體系酸度pH=7.0，充分混合，室溫下反應(yīng)80 min；在上一步的混合溶液中加入60 μL 4 μmol/L 噻唑橙溶液充分振蕩，用超純水定容至200 μL，繼續(xù)在室溫下反應(yīng)25 min，同時配制空白。將混合的溶液轉(zhuǎn)移至超微量熒光比色皿中，用分光光度計記錄500～630 nm內(nèi)的熒光光譜，分別測定溶液熒光強度F和空白值F0。

1.2.2 體系pH值優(yōu)化 在EP管中加入核酸適配體和噻唑橙溶液充分振蕩，加入相同量的不同pH的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L)，控制pH為3～9，加超純水至總體積為200 μL，室溫下反應(yīng)25 min，測定不同pH下的熒光強度。

1.2.3 噻唑橙—適配體濃度比的優(yōu)化 固定噻唑橙與適配體混合物的總體積，加入不同體積的噻唑橙與適配體，使其摩爾比分別為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，加入35 μL 100 mmol/L的HEPES溶液，定容，pH值控制為7，室溫下反應(yīng)25 min，測定體系熒光強度。

1.2.4 噻唑橙與適配體結(jié)合時間的優(yōu)化 在EP管中加入相同核酸適配體，加入適當?shù)泥邕虺热芤菏蛊淠柋葹?∶3，加入35 μL 100 mmol/L的HEPES溶液，控制溶液pH為7，加超純水至總體積200 μL，選擇不同的時間點測體系的熒光強度。

1.2.5 適配體與鎘離子結(jié)合時間的優(yōu)化 向一系列EP管中加入相同的核酸適配體和鎘離子標準溶液，常溫下分別反應(yīng)0，10，20，30，40，50，60 min，加入相同量的噻唑橙溶液，使噻唑橙與適配體濃度比為7∶3，加入35 μL 100 mmol/L的HEPES溶液，定容，室溫下反應(yīng)25 min，測定體系熒光強度。

1.2.6 熒光檢測的特異性 向不同的EP管中加入等量的核酸適配體，加入35 μL HEPES溶液使體系pH為7，分別加入50 ng/mL的8種不同的金屬離子(鉀、鈣、鎂、鋅、鐵、銅、鉛、鉻)和鎘離子混合均勻，常溫下反應(yīng)20 min，再加入等量噻唑橙溶液使噻唑橙與適配體濃度比為7∶3，繼續(xù)反應(yīng)15 min，測定熒光強度，并與空白相比較。

1.2.7 實際樣品前處理 用試驗建立的方法對水樣A、B、C中的重金屬鎘離子含量進行檢測分析。將水樣用0.2 mm注射過濾器對水樣品進行過濾，添加2 ng/mL濃度的鎘離子標品，用試驗建立的方法檢測，測得鎘離子的濃度值并計算回收率，與石墨爐原子吸收光譜進行比較。

1.2.8 石墨爐原子吸收光譜法檢測 將水樣放置于自動進樣器中，調(diào)整自動進樣器與石墨管的距離，設(shè)置試驗參數(shù)分別為進樣體積10 μL，波長228.8 nm，電流4 mA等，隨后開始進行水樣中鎘的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘離子熒光檢測設(shè)計原理

如圖1所示，當噻唑橙溶液在485 nm的激發(fā)光下，在510～610 nm的范圍內(nèi)沒有發(fā)射峰；當噻唑橙與適配體結(jié)合后，熒光強度顯著增強，在535 nm處出現(xiàn)峰值；當有鎘離子存在時，體系熒光強度降低。噻唑橙在游離狀態(tài)下，熒光產(chǎn)率低，與適配體結(jié)合后，通過插入堿基對、與帶負電的磷酸骨架結(jié)合或與小溝槽結(jié)合而產(chǎn)生熒光效應(yīng)[22]，當有Cd2+存在時，適配體優(yōu)先與Cd2+結(jié)合，阻礙噻唑橙與適配體的結(jié)合，熒光強度降低。

圖1 鎘離子檢測熒光光譜圖

Figure 1 Fluorescence spectrogram of cadmium ion detection

2.2 體系pH對熒光強度的影響

由圖2可知，pH在3～4時檢測體系的熒光值隨pH的升高而升高，當pH>4時，隨著pH的升高而降低，當pH=4時熒光值最大。該結(jié)果與Kang等[21]的試驗結(jié)果一致，在酸性條件下噻唑橙與適配體結(jié)合產(chǎn)生的熒光較中性及堿性條件下大。體系pH>7時，熒光強度變化小，比在酸性條件下更為穩(wěn)定，因此檢測鎘離子的最佳pH值為7。

圖2 溶液pH對熒光強度的影響

2.3 噻唑橙與適配體濃度比對熒光強度的影響

由圖3可知，體系在最大發(fā)射波長的熒光強度隨噻唑橙與適配體的濃度比增加先升高后降低，當噻唑橙與適配體的比值為7∶3時熒光強度最大。噻唑橙與適配體的濃度比對熒光強度起著重要作用，濃度比太低時，核酸濃度低產(chǎn)生的噻唑橙—適配體復合物濃度低，熒光強度弱；濃度比高時，適配體濃度大，影響熒光檢測的靈敏度。當噻唑橙與適配體處于7∶3的比值時，熒光強度最強，適配體濃度約為0.46 μmol/L，與Sun等[23]采用的適配體濃度相近。因此試驗中以7∶3作為噻唑橙與適配體的最佳摩爾比。

2.4 噻唑橙與適配體結(jié)合時間的優(yōu)化

如圖4所示，體系的熒光強度在10 min以內(nèi)迅速增加，在10～15 min時熒光增強速度變緩，15 min后混合液的熒光強度基本保持不變，此時適配體與噻唑橙充分反應(yīng)，熒光強度達最大值。噻唑橙與適配體結(jié)合的時間對熒光產(chǎn)率的影響是很重要的因素[24]，反應(yīng)時間太短，噻唑橙與適配體結(jié)合不夠完全，熒光信號未達到穩(wěn)定，所以試驗中以15 min作為噻唑橙與適配體反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間。

圖3 噻唑橙與適配體濃度比對熒光強度的影響

Figure 3 Effect of concentration ratio of TO and Apta-mer on fluorescence intensity

圖4 噻唑橙與適配體結(jié)合時間的優(yōu)化

2.5 適配體與鎘離子反應(yīng)時間的優(yōu)化

如圖5所示，隨著孵育時間的增加，熒光差值(F-F0)增大，當孵育時間>20 min時，熒光差值保持穩(wěn)定無變化，此時溶液中鎘離子與適配體反應(yīng)充分，熒光強度不再降低。若適配體與鎘離子反應(yīng)時間不足，體系未達到平衡，將影響檢測結(jié)果。為此，選擇20 min為適配體與靶標物質(zhì)鎘離子的最佳孵育時間。

2.6 檢出限與線性范圍

在最佳的試驗條件下，用試驗建立的方法對不同濃度的鎘離子標準液進行檢測，發(fā)現(xiàn)鎘離子濃度與體系的熒光強度在2.00～80.00 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性(見圖6)，校正曲線方程y=-2.340 6x+284.73，檢出限為0.23 ng/mL,與Zhu等[25]通過對適配體修飾檢測的方法相比較，檢出限接近，但試驗建立的方法不需要對適配體進行修飾，只需簡單的混合，操作方便，而且線性范圍較廣。

圖5 適配體與鎘離子反應(yīng)時間的優(yōu)化

Figure 5 Optimization of reaction time between Aptamer and cadmium ions

圖6 熒光強度與鎘離子的線性關(guān)系圖

Figure 6 Linear relationship between fluorescence intensity and cadmium ion

圖7 選擇性分析

2.7 特異性

選擇了8種不同的金屬離子(鉀、鈣、鎂、鋅、鐵銅、鉛、鉻)與鎘離子在最優(yōu)試驗條件下進行檢測，結(jié)果如圖7所示。與其他金屬離子相比，加入鎘離子的體系熒光差值最大，熒光強度變化(ΔF)明顯，Mg2+等對Cd2+的檢測有一定的影響，加入Mg2+和Pb2+的檢測體系也引起了不可忽視的熒光強度變化，與Wu等[18]的研究結(jié)果相似。除Mg2+與Pb2+外，試驗建立的方法具有較好的特異性。為了提高方法的選擇性，Cao等[26]通過使用螯合劑的策略掩蓋部分離子，在后續(xù)的研究中可以利用螯合劑(如：PDCA和NTA等)降低Pb2+、Mg2+對熒光檢測的影響。

2.8 實際樣品檢測

用試驗建立的方法對3種不同的水樣品進行加標回收試驗，將所得的結(jié)果與石墨爐原子吸收光譜法相比較(GB 5009.15—2014)。經(jīng)檢測未加標的水樣品中本底值分別為3.082 2，3.568 4，2.646 4 ng/mL，扣除本底值所得的結(jié)果見表1。

由表1可知，試驗建立的方法檢測實際樣品所得結(jié)果與原子吸收光譜法相比較差異小，有較好的回收率，且具有較好的準確性和穩(wěn)定性，表明所建方法可用于鎘離子的實際樣品檢測。

表1 鎘離子加標回收率

3 結(jié)論

試驗建立了一種基于鎘離子核酸適配體無標記檢測鎘離子的熒光方法，其最佳熒光檢測條件為：pH值7、噻唑橙—適配體濃度比7∶3、噻唑橙與適配體結(jié)合時間15 min、適配體與鎘離子結(jié)合時間20 min。在此條件下，熒光強度與鎘離子濃度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性范圍為2.00～80.00 ng/mL，檢測限為0.23 ng/mL，但對鎘離子檢測的特異性還有待加強，后續(xù)研究可通過對干擾離子進行屏蔽或者信號擴增等方法增強。