冷鏈條件下馬鮫魚優勢腐敗菌生長動力學研究及貨架期預測

邢家溧 - 徐曉蓉 - 承 海 鄭睿行 - 張書芬 - 傅 曉 周子焱 - 毛玲燕 -

(1.寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江 寧波 315048；2.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211)

馬鮫魚又被稱為鯖魚(Scomberomorousniphonius)，是中國尤其是中國東部和東南部重要的水產養殖物種之一[1]，同時也是頗具商業價值的深海魚種[2]。近年來，由于大小黃魚等一些經濟魚類資源越來越短缺后，馬鮫魚因繁殖快、捕撈量可觀等原因已成為中國沿海城市最重要的漁業資源之一[3]。此外，馬鮫魚不僅刺少肉多，且營養豐富，味道鮮美，深受沿海及內陸居民的喜愛，逐漸成為餐桌上不可或缺的美味佳肴[4]。但是由于目前水產品流通保鮮技術不完善，馬鮫魚在長途運輸中極易受到微生物繁殖的影響而導致其腐敗變質。新鮮水產品在運輸貯藏期間，有小部分微生物逐漸占據生長優勢，同時伴隨著不愉快氣味的出現，該類微生物一般被稱為此水產品的特定腐敗菌(Specific spoilage organism，SSO)[5]，特定腐敗菌的繁殖情況與水產品新鮮度下降速率密切相關。綜上所述，當前亟需建立與馬鮫魚新鮮度下降有關聯的特定腐敗菌動態生長模型，以達到預測其貨架期的目的，這無疑將是減緩馬鮫魚新鮮度下降的重要手段之一[6-7]。

目前一般采用低溫冷鏈貯藏來減緩水產品中微生物的繁殖速率，顯然，貯藏溫度的高低是決定水產品貨架期的關鍵因素，不同貯藏溫度對同一水產品的品質和貨架期影響差異顯著[8-10]。研究[11]表明當前冷鏈物流系統一般將溫度控制在0～20 ℃。目前關于水產品貨架期預測模型的研究主要為一級和二級模型，一級生長模型主要采用修正的Gompertz方程，二級模型一般采用Belehradek方程，主要用于表達不同環境因素(如溫度、水分活度、氛圍氣體等)對腐敗菌繁殖的影響[12-13]。如張李浩[14]8-12利用以上兩個方程建立了羅非魚在0～15 ℃貯藏溫度下優勢腐敗菌的一級和二級生長模型，并用4，8 ℃的羅非魚貯藏數據進行驗證，貨架期誤差為±10%。李蕾蕾[15]7-13應用修正的Gompertz方程和Belehradek方程建立了南美白對蝦腐敗菌在0～20 ℃的一級、二級生長動力模型，并用7，10 ℃的腐敗菌生長數據對模型進行驗證，所得貨架期相對誤差<5%。當前針對馬鮫魚的研究還只限于其品質在不同貯藏溫度下的變化情況，利用數學方程建立馬鮫魚優勢腐敗菌生長動態及貨架期預測模型還尚未有相關報道。

試驗擬研究馬鮫魚在0，4，10 ℃ 3個典型冷鏈溫度中的優勢腐敗菌及其生長動態，并在此基礎上建立馬鮫魚在0～10 ℃溫度范圍內優勢腐敗菌的生長動力學一級、二級模型和貨架期預測模型，且用2，8 ℃冷鏈貯藏中的馬鮫魚優勢腐敗菌試驗結果驗證模型的準確性和科學性，以期達到快速預判馬鮫魚在冷鏈流通過程中的新鮮度與貨架期的目的，為研究馬鮫魚保鮮技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鮫魚：寧波舟山港，挑選的馬鮫魚在體型與質量上保持基本一致(體長約為280 mm，質量為500 g左右)；

營養瓊脂培養基(PCA)、鐵瓊脂培養基(IA)、假單胞菌專用培養基(CFC)：北京陸橋技術股份有限公司；

碳酸鈉、濃鹽酸、硫酸鎂、過氯酸、原硼酸等：分析純，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平：JA5003N型，上海丙林電子科技有限公司；

磁力攪拌器：99-1型，上海甄明科學儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：8002型，上海森信實驗設備有限公司；

標準超凈工作臺：SW-CJ-2FB 型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

高壓滅菌鍋：MLS-3750型，上海智巖科學儀器有限公司；

恒溫恒濕培養箱：MGC-350HPY-2型，上海精天電子儀器有限公司；

高精度培養箱：MIR153型，日本Sanyo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 新鮮馬鮫魚按照層冰層魚的堆疊方式均勻放置于同規格(內徑尺寸：55 cm×30 cm×20 cm)的海鮮專用泡沫箱中，為了防止魚體之間以及魚體與冰之間產生交叉污染和摩擦損壞，每條馬鮫魚都單獨袋裝，最上層碎冰面與泡沫箱蓋間距約5 cm。將包裝好的馬鮫魚在0，4，10 ℃進行冷鏈模擬運輸及貯藏，試驗中采用設定搖床轉速為50 r/min模擬運輸來模擬馬鮫魚實際運輸中的振蕩幅度，整個模擬過程處于避光狀態。此外，在貯藏過程中需及時更換碎冰并清理由冰融化的水。每次隨機取3尾馬鮫魚，試驗檢測部位均為馬鮫魚背部中段。

1.3.2 感官評定 采用質量指標法[16](QIM)。感官評定專家由10名專業感官評審專家組成(男女比例一致，平均年齡35歲)，隨機抽取不同貯藏期的馬鮫魚按照體表、氣味、魚鰓、肌肉彈性及眼睛狀況5方面對其進行感官品質評定。QIM法中不同參數的分值范圍在0～10，分值越高，品質越好，將各個參數分值按照20%權重比例相加，得出最終質量指標(QI值)，若馬鮫魚QI值低于5分，則表明馬鮫魚不能食用，以此確定感官拒絕點的時間。馬鮫魚感官評價參照徐曉蓉等[17]的評價標準。

1.3.3 揮發性鹽基氮(TVB-N)測定 按GB 5009.228—2016執行，結果表示為每100 g樣品中所含有的TVB-N毫克數。

1.3.4 微生物計數 馬鮫魚中菌落總數(TVC)、假單胞菌和希瓦氏菌的測定按GB 4789.2—2016執行，結果表示為lg(CFU/g)。具體操作：稱取25 g馬鮫魚魚肉糜置于盛有225 mL無菌生理鹽水的無菌袋中，混合均勻后以10倍梯度稀釋，根據不同貯藏時間，選取2～3個合適的稀釋度，每個稀釋度作3個平行。其中，PCA培養基用于測定TVC，在30 ℃下培養72 h進行計數，假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養基用于測定假單胞菌含量，一般在30 ℃培養48 h后計數。IA培養基用于測定希瓦氏菌，其在30 ℃下培養48 h計數。

1.3.5 優勢腐敗菌動態生長模型的建立 利用修正的Gompertz模型[18]描述不同冷鏈溫度下馬鮫魚特定腐敗菌的生長動態，公式為：

(1)

式中：

t——時間，h；

N(t)——t時菌數，CFU/g；

Nmax——最大菌數，CFU/g；

N0——初始菌數，CFU/g；

μmax——微生物生長的最大比生長速率，h-1；

λ——微生物生長的延滯時間，h。

優勢腐敗菌生長動態二級模型主要描述溫度與腐敗菌動力學參數(μmax和λ)的關系。采用Belehradek平方根方程[19]描述溫度對優勢腐敗菌最大比生長速率μmax和延滯期λ的影響。Belehradek方程為：

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)，

(2)

μmax1/2=bμmax(T-Tminμ)，

(3)

式中：

b——常數；

T——溫度，K；

Tmin——生長最低溫度(即最大比生長速率為零時的溫度)，℃。

1.3.6 生長預測模型準確性評價 采用偏差度Bf和準確度Af來評價已建立的微生物生長動力學預測模型的科學性，若Bf、Af都為1，則表示所建模型預測值與實測值完全吻合[20]，偏差度Bf和準確度Af的公式為：

(4)

(5)

式中：

N實測——試驗測定的特定腐敗菌，CFU/g；

N預測——N實測同一時間通過生長動力學模型計算所得的特定腐敗菌的預測值，CFU/g；

n——試驗次數。

1.3.7 馬鮫魚貨架期預測與評價 根據建立的馬鮫魚優勢腐敗菌的一級、二級生長動力模型，再利用其優勢腐敗菌從起始菌落數目(N0)增至感官排斥點時的最小腐敗菌數量(Ns)所需要的時間來進行貨架期的預測[21]。貨架期預測公式如下：

(6)

將實際貯藏在2，8 ℃的冷鏈馬鮫魚試驗所得的貨架期數據與所建模型預測的貨架期數據進行對比分析，驗證建立的馬鮫魚貨架期預測模型的準確性，一般用相對誤差[22]來描述。

(7)

式中：

RE——相對誤差，%；

SLyc——所建模型預測的貨架期值，h；

SLsc——所建模型實測的貨架期值，h。

1.4 數據處理

TVB-N、TVC、假單胞菌數、希瓦氏菌數采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，結果均以(平均值±標準差)表示；作圖采用Origin 8.6；微生物一級生長動力模型采用修正的Gompertz方程描述，微生物二級生長動力模型采用修正的Belehradek方程描述。

2 結果與分析

2.1 特定腐敗菌及其最小腐敗量Ns的確定

馬鮫魚在貯藏期間會產生多種微生物，但是只有其中的一種或幾種才會作用于馬鮫魚的腐敗變質，即特定優勢腐敗菌(SSO)。研究[23]表明，深海魚類中的優勢腐敗菌一般為假單胞菌和(或)希瓦氏菌。圖1為馬鮫魚在0，4，10 ℃冷鏈溫度下，其肌肉中菌落總數、假單胞菌數以及希瓦氏菌含量變化狀況。從圖1中可以看出，馬鮫魚在3種溫度貯藏下都呈現出菌落總數>假單胞菌數>希瓦氏菌數的變化趨勢。從貯藏初期至末期，假單胞菌數量逐漸接近于菌落總數，成為優勢菌群，而希瓦氏菌數卻隨著貯藏時間的延長逐漸落后于菌落總數，在馬鮫魚貯藏后期不具備生長優勢。當貯藏末期時，0 ℃冷鏈馬鮫魚中的菌落總數、假單胞菌數及希瓦氏菌數分別為(8.03±0.14)，(7.86±0.17)，(6.75±0.17)lg(CFU/g)，4 ℃冷鏈馬鮫魚中的菌落總數、假單胞菌數及希瓦氏菌數分別為(8.43±0.17)，(8.23±0.11)，(7.02±0.09)lg(CFU/g)，10 ℃冷鏈馬鮫魚中的菌落總數、假單胞菌數和希瓦氏菌數分別為(8.43±0.16)，(8.12±0.23)，(6.62±0.15)lg(CFU/g)。由此可見，假單胞菌更適合作為冷鏈馬鮫魚的腐敗指示菌，該結果與試驗前期利用宏基因測序對這3種溫度下馬鮫魚貯藏過程中優勢腐敗菌的試驗結果一致。張晨雪等[24]對貯藏于低溫環境下的鲅魚中微生物含量的研究中確定假單胞菌的生長要優于希瓦氏菌，該結果與試驗一致。

為了達到精準預測不同貯藏溫度下馬鮫魚貨架期的目的，不僅需要確定馬鮫魚的優勢腐敗菌，還要確定其SSO的起始菌落數量(N0)與感官排斥點時的優勢腐敗菌的最小腐敗量(Ns)[15]10。由表1可知，冷鏈馬鮫魚在兩種不同溫度下貨架期終點時的QI值集中在5分以下，此時馬鮫魚已處于腐敗狀態，無論是外觀色澤還是魚肉硬度都已超出消費者可接受范圍。同時，TVB-N的含量為(30.13±0.94)mg/100 g，該含量已超過海水魚類中TVB-N的含量臨界值(30 mg/100 g)[25]，表明當假單胞菌數超過上述含量時，馬鮫魚基本已處于腐敗狀態。因此，可以確定假單胞菌的最小腐敗量(Ns)為(7.64±0.03)lg(CFU/g)，根據假單胞菌的生長規律和最小腐敗量(Ns)可以預測冷鏈馬鮫魚的貨架期。

圖1 不同冷鏈溫度下馬鮫魚菌落總數、假單胞菌數及希瓦氏菌數的變化

表1 不同冷鏈溫度下馬鮫魚初始及貨架期終點的特定腐敗菌數、TVB-N含量和QI值

2.2 冷鏈馬鮫魚特定腐敗菌的生長曲線(一級模型)

優勢腐敗菌的一級模型描述的是在特定環境下其數量和時間的關系[26]。根據構建的一級生長模型可以預測出某一時間的優勢腐敗菌數量。目前，用于研究優勢腐敗菌一級動態生長的數學模型并不單一，主要有以下幾種：Logistics方程、Gompertz方程、Richards方程等[27]。依照相關文獻[28]報道，修正的Gompertz方程因其準確性高、計算簡便在優勢腐敗菌的一級生長動力學研究中更受青睞。圖3為不同冷鏈溫度(0，4，10 ℃)貯藏下馬鮫魚魚肉中含有的假單胞菌數采用修正的Gompertz方程對其生長曲線進行的擬合。由圖2和表2可知，0，4，10 ℃冷鏈溫度下的馬鮫魚生長曲線均呈“S”型，并且曲線的擬合系數R2較高，均大于0.99，殘差平方和(χ2)均較小，說明修正的Gompertz方程能準確描述不同冷鏈溫度下的假單胞菌生長規律。張李浩[14]14在對冷藏羅非魚中假單胞菌生長規律的研究中得出與試驗類似的結論。試驗中假單胞菌的起始菌落數還未超過4 lg(CFU/g)，表明樣品還未進入腐敗狀態[29]，這與模型的成功建立要求相符，貨架期終點階段的最大菌落數集中在8 lg(CFU/g)，0，4，10 ℃的假單胞菌最大比生長速率μmax分別為0.028 6，0.033 6，0.072 3 h-1，遲滯期λ分別為20.68，10.85，4.25 h。顯而易見，假單胞菌的最大比生長速率與遲滯期的變化都和冷鏈馬鮫魚的貯藏溫度有關，從上述結果可知，冷鏈馬鮫魚貯藏溫度越高，其SSO的最大比生長速率越大，但是遲滯期越短[30]。造成這種現象的原因可能是貯藏溫度低于假單胞菌的生長最適溫度，假單胞菌增值適應期變長，使得假單胞菌生長速率變緩，且溫度越低對其生長速率抑制效果越明顯，說明低溫冷鏈處理對馬鮫魚SSO的生長有明顯干擾作用，對延緩其腐敗變質具有一定成效。

圖2 不同冷鏈溫度下馬鮫魚中假單胞菌生長曲線

Figure 2 Growth curves ofPseudomonasin Spanish mackerel stored at different cold-chain temperatures(n=3)

表2 不同冷鏈溫度下馬鮫魚優勢腐敗菌生長動力學參數

Table 2 Kinetic parameters in Spanish mackerel ofPseudomonasgrowth at different cold-chain temperatures

溫度/℃R2χ2λ/hμmax/h-1Nmax/(lgCFU·g-1)00.99710.005920.680.02867.8640.99810.004510.850.03368.23100.99690.00824.250.07238.12

將表2中各個溫度的最大比生長速率、遲滯期代入修正的Gompertz方程，得到如下馬鮫魚中SSO在0，4，10 ℃的生長動力學模型：

(1)0 ℃條件下假單胞菌的生長動力學模型：

(8)

(2)4 ℃條件下假單胞菌的生長動力學模型：

(9)

(3)10 ℃條件下假單胞菌的生長動力學模型：

(10)

2.3 溫度對馬鮫魚優勢腐敗菌生長動力學參數的影響(二級模型)

二級模型Belehradek方程常用于闡述微生物一級動態生長模型中的參數(μmax、λ等)與環境因素(溫度、Aw、空氣濕度等)之間的函數關系，試驗采用Belehradek方程對冷鏈貯藏溫度與Gompertz方程所得的假單胞菌最大比生長速率(μmax)和延滯期(λ)的關系進行描述[31-32]。從圖3可知，Belehradek方程對馬鮫魚肉中假單胞菌的生長速率和延滯期與溫度的擬合系數>0.90，表明所建立的二級模型具有較高的可信度，同時也說明Belehradek方程能較好地描述不同冷鏈貯藏溫度對馬鮫魚假單胞菌的μmax和λ的作用，揭示了冷鏈馬鮫魚SSO隨溫度變化而表現出的規律。其中，許鐘等[12]對不同貯藏溫度下的羅非魚中假單胞菌的生長規律和藍蔚青等[33]對不同貯藏溫度下的鱸魚中優勢腐敗菌的生長規律進行研究時得到的結果都與試驗類似。

圖3 Belehradek方程中溫度與假單胞菌最大比生長速率(μmax)、延滯期(λ)的關系

Figure 3 Effect of temperature on maximum specific growth rate(μmax)and lag phase(λ)ofPseudomonaswith Belehradek equation

溫度與馬鮫魚SSO最大比生長速率(μmax)和延滯期(λ)的Belehradek方程為：

(1/λ)1/2=0.026 7T+0.213 7，

(11)

μmax1/2=0.007 8T+0.173 9。

(12)

2.4 微生物生長預測模型的建立與可靠性評價

為客觀評估所建模型的準確性和科學性，試驗采用準確度(Af)、偏差度(Bf)作為評判指標來描述[34]。若Bf在10%以內，即處于0.90～1.10，Af為20%以內，即0.80～1.20，則表明建立的預測模型能有效預測產品中的微生物生長規律[35]。冷鏈馬鮫魚在2 ℃ 和 8 ℃貯藏過程中，其肌肉中SSO假單胞菌的生長動力學參數μmax、λ以及Nmax的實測值與采用Belehradek方程求得的預測值之間的比較結果如表3所示。表4為冷鏈馬鮫魚在不同貯藏溫度下的預測值偏差度Bf和準確度Af結果。由表4可知，試驗建立的生長模型對貯藏于2，8 ℃的冷鏈馬鮫魚肉中的假單胞菌生長動態具有很好地預測能力，偏差度為1.010 4～1.024 5，準確度為1.026 8～1.038 7，都處于兩個評價指標的可接受范圍之內，表明試驗建立的預測模型能較好預測冷鏈馬鮫魚在0～10 ℃范圍內假單胞菌的生長動態。

表3 冷鏈馬鮫魚在2，8 ℃貯藏中SSO生長動力學模型參數的預測和實測值

表4 冷鏈馬鮫魚在2，8 ℃貯藏中假單胞菌預測值結果評價

Table 4 Evaluation of predicted contents ofPseudomonasin cold-chain Spanish mackerel stored at 2 ℃ and 8 ℃

貯藏溫度/℃試驗次數偏差度準確度2201.01041.03878201.02451.0268

2.5 馬鮫魚剩余貨架期模型建立與評價

按照冷鏈馬鮫魚肉中假單胞菌生長動力學模型，根據假單胞菌從最初菌數N0增長至感官下限時的最小SSO數量Ns所需要的時間來預測貨架期終點。由表1、2可知，假單胞菌的最小腐敗量Ns為7.64 lg(CFU/g)，最大菌數Nmax為8.07 lg(CFU/g)，此時，只需測定冷鏈馬鮫魚剛捕撈時的假單胞菌數N0以及貯藏溫度，即可利用Belehradek方程計算馬鮫魚在0～10 ℃的最大比生長速率(μmax)和延滯期(λ)值，由式(6)求出該溫度范圍內的剩余貨架期[36]。0～10 ℃的剩余貨架期計算公式為：

(13)

表5為冷鏈馬鮫魚貯藏在2,8 ℃時，貨架期實測值與預測值兩者之間的比較結果。評價預測值的可靠性由相對誤差大小決定，其中2 ℃貯藏的冷鏈馬鮫魚貨架期預測與實測之間的相對誤差為6.09%，8 ℃時貨架期預測值與實測值的相對誤差為8.95%，兩者均小于10%。表明利用建立的假單胞菌生長動力學模型，預測0～10 ℃貯藏溫度內冷鏈馬鮫魚的貨架期時所得的結果較為可靠。

表5 冷鏈馬鮫魚在2，8 ℃貯藏過程中貨架期模型評價

Table 5 Evaluation of shelf life prediction models for cold-chain Spanish mackerel storted at 2 ℃ and 8 ℃

貯藏溫度/℃預測SL/h實測SL/h相對誤差/%2178.231686.098111.131028.95

3 結論

利用修正的Gompertz方程構建了0，4，10 ℃溫度條件下冷鏈馬鮫魚特定腐敗菌假單胞菌的一級生長動力學模型，擬合度R2高達0.99。利用微生物二級模型Belehradek方程構建了冷鏈馬鮫魚假單胞菌的二級生長動態模型，所建模型的擬合度R2>0.90。將馬鮫魚在2，8 ℃下進行冷鏈模擬貯藏，測定假單胞菌的繁殖狀況，同時對所建立的假單胞菌二級生長模型進行了準確度評價及可信度分析。試驗中冷鏈馬鮫魚假單胞菌在不同冷鏈溫度貯藏過程中預測值與實測值之間的偏差度為1.010 4～1.024 5，準確度為1.026 8～1.038 7。表明建立的特定腐敗菌生長預測模型能很好的擬合出假單胞菌在0～10 ℃溫度范圍內的生長情況。此外，在馬鮫魚不同冷鏈貯藏下假單胞菌一級、二級生長動力學基礎上建立的貨架期預測模型預測馬鮫魚在2，8 ℃的貨架期與試驗所得貨架期的相對誤差分別為6.09%，8.95%，上述結果說明研究構建的馬鮫魚假單胞菌一級、二級生長模型以及貨架期預測模型均可迅速、可靠地預測馬鮫魚在0～10 ℃冷鏈溫度范圍內的剩余貨架期。在后期還將針對實際貯藏環境下的馬鮫魚腐敗情況進行更深入的研究，使得所建模型更為可靠，應用性更強。