余甘子葉總黃酮的超聲波法提取工藝優化及其抗氧化能力研究

杜麗娟 - 蘇秀芳 - 黃成銀 -

(1.廣西民族師范學院生物與食品工程學院，廣西 崇左 532200；2.廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室培育基地，廣西 崇左 532200)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)為大戟科葉下珠屬植物，廣泛分布于廣東、廣西、云南等[1]。余甘子營養豐富，是一種難得的食藥兩用物質，被聯合國衛生組織指定為在世界范圍內推廣種植的3種保健植物之一[2]。目前，余甘子果實的研究主要集中于黃酮、單寧等物質的提取[3]；抗氧化、護肝[4]、防癌[5]等功能性的評價；果酒[6]、果醋[7]、含片等功能性食品或藥品的研究開發。張倫等[8]對比了余甘子樹枝、樹皮、樹葉等組織原花色素的質量濃度及抗氧化能力，李舒等[9-10]測定了余甘子葉總黃酮含量，并分析了其藥理作用機理，有關余甘子葉總黃酮提取工藝及抗氧化能力的研究尚未見報道。

黃酮是一大類化合物的總稱，其在植物中的含量因植物品種差異較大[11]。黃酮具有多種功效，如抗氧化、抗炎、降血糖等作用[12]。Tung等[13]發現余甘子對非酒精性脂肪肝炎具有一定的保護作用，可能與其活性物質黃酮成分密切相關。常用的黃酮提取技術有微波輔助法、乙醇回流法和超聲提取法等[14]。微波輔助法快速高效，但產熱不均勻，易出現局部位置溫度高，破壞有效成分[15]；乙醇回流法是傳統提取方法，簡單易操作，但提取時間長，產率低[16]；超聲提取法有助于細胞內物質更好地溶出，具有提取率高、時間短的特點[17-18]。試驗擬以余甘子葉為原料，采用超聲法提取總黃酮并分析其抗氧化能力，以期為余甘子葉的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

余甘子葉：廣西民族師范學院；

蘆丁：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

DPPH：純度≥97%，上海藍季科技發展有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、30%過氧化氫、水楊酸、抗壞血酸、石油醚、檸檬酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、磷酸氫二鈉、七水合硫酸亞鐵等：分析純。

1.1.2 儀器與設備

可見分光光度計：VIS-722N型，北京瑞利分析儀器公司；

數控超聲波清洗儀：SG1200HE型，上海冠特超聲儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：SG1200HE型，北京市永光明醫療儀器有限公司；

分析天平：AR124CN型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

高速萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

循環水式多用真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，河南省予華儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 余甘子葉預處理 根據文獻[19]修改如下：取完好無損的余甘子葉片，用自來水清洗3次，再用蒸餾水洗凈，陰涼處自然瀝干，60 ℃恒溫烘箱中烘至恒重，粉碎，粉末置于1 000 mL錐形瓶中，按料液比1∶30(g/mL)加入沸程為60～90 ℃的石油醚，攪拌混合，除色除脂(3次)，過濾。將脫色脫脂的余甘子葉粉末烘干備用。

1.2.2 余甘子葉總黃酮得率的測定

(1)標準曲線的繪制：準確稱取0.020 0 g蘆丁標準品，用50%乙醇溶解轉移至50 mL容量瓶并定容。用移液管分別吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于25 mL的比色管中，然后依次加入5% NaNO2溶液0.40 mL、10% Al(NO3)3溶液0.40 mL、4% NaOH溶液5 mL，每次加入試劑后搖勻靜置6 min，并定容至25 mL，于510 nm處測定吸光值。得曲線方程y=10.986x-0.002 7，R2= 0.999 8。

(2)余甘子葉總黃酮含量的計算：稱取0.500 0 g余甘子葉粉末，置于錐形瓶中并加入適量的50%乙醇，搖勻后密封，特定條件下進行提取，抽濾，將濾液定容于100 mL容量瓶。取1.00 mL提取液于25 mL容量瓶中，按1.2.2(1)添加試劑，于510 nm處測定吸光值。采用50%乙醇溶液為空白對照，并按式(1)計算總黃酮得率。

(1)

式中：

F——總黃酮得率，%；

C——總黃酮濃度，mg/mL；

V——樣品溶液體積，mL；

X——稀釋倍數；

M——余甘子葉粉末質量，mg。

1.2.3 單因素試驗

(1)料液比：在乙醇濃度50%、超聲功率50 W、提取時間20 min，提取溫度50 ℃下，考察料液比[1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)]對總黃酮得率的影響。

(2)乙醇濃度：在料液比1∶25(g/mL)、超聲功率50 W、提取溫度50 ℃，提取時間20 min下，考察乙醇濃度(30%，40%，50%，60%，70%)對總黃酮得率的影響。

(3)超聲功率：在料液比1∶25(g/mL)、乙醇濃度50%、提取溫度50 ℃，提取時間20 min下，考察超聲功率(30，40，50，60，70 W)對總黃酮得率的影響。

(4)提取溫度：在料液比1∶25(g/mL)、乙醇濃度50%、超聲功率60 W，提取時間20 min下，考察提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)對總黃酮得率的影響。

(5)提取時間：在料液比1∶25(g/mL)、乙醇濃度50%、超聲功率60 W，提取溫度60 ℃下，考察提取時間(10，20，30，40，50 min)對總黃酮得率的影響。

1.2.4 抗氧化能力

(1)對·OH清除能力的測定：根據文獻[20]修改如下：依次移取不同濃度的余甘子葉總黃酮提取液(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL)2.0 mL、9.9 mmol /L水楊酸1.0 mL、9.9 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL放入比色管中，搖勻，37 ℃水浴30 min，于510 nm處測定吸光值。以蒸餾水代替H2O2為對照組，以蒸餾水代替余甘子葉總黃酮提取液為空白組測定吸光值，以抗壞血酸(VC)為陽性對照，按式(2)計算·OH清除率。

(2)

式中：

C——·OH清除率，%；

A1——樣液組吸光值；

A2——對照組吸光值；

A0——空白組吸光值。

(2)對DPPH·清除能力的測定：根據文獻[21]，修改如下：依次移取不同濃度的余甘子葉總黃酮提取液(0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL)2.0 mL、0.25 mmol/L DPPH—乙醇溶液2.0 mL放入比色管中，暗處反應30 min，于517 nm處測吸光值；以無水乙醇為對照，抗壞血酸(VC)為陽性對照，并按式(3)計算DPPH·清除率。

(3)

式中：

C——DPPH·清除率，%；

A1——樣液與DPPH混合后的吸光值；

A2——樣液與乙醇混合后的吸光值；

A0——DPPH與乙醇混合后的吸光值。

(3)對NaNO2清除能力的測定：根據文獻[22]修改如下：依次移取不同濃度的余甘子葉總黃酮提取液(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μg/mL)2.0 mL，5 μg/mL NaNO2溶液2.0 mL及pH=3的檸檬酸—鹽酸緩沖液3.0 mL放入比色管中，37 ℃水浴1 h，冷卻，加入0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，5 min后再加入0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，靜置15 min，于540 nm處測定吸光值。以60%乙醇為空白對照，抗壞血酸(VC)為陽性對照，按式(4)計算NaNO2清除率。

(4)

式中：

C——NaNO2清除率，%；

A0——樣液組吸光值；

A——對照組吸光值。

1.3 數據處理

所有數據測定3次，取均值，采用 Origin 8.5、SPSS 19.0軟件進行繪制和數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對余甘子葉總黃酮得率的影響 由圖1可知，余甘子葉總黃酮物質得率隨料液比的增加先增加后減小，當料液比為1∶25(g/mL)時達最大值(13.91%)。因此，最適料液比為1∶25(g/mL)。

2.1.2 乙醇濃度對余甘子葉總黃酮得率的影響 由圖2可知，余甘子葉總黃酮物質得率隨乙醇濃度的增大先上升后下降，當乙醇濃度為50%時達最大值(13.91%)。因此，最適乙醇濃度為50%。

圖1 料液比對余甘子葉總黃酮得率的影響

Figure 1 Effect of material and liquid ratio on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

圖2 乙醇濃度對余甘子葉總黃酮得率的影響

Figure 2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

2.1.3 超聲功率對余甘子葉總黃酮得率的影響 由圖3可知，余甘子葉總黃酮物質得率隨超聲功率的增大先上升后下降。當超聲功率為60 W時，得率高達13.97%。超聲功率越大，破壞細胞壁的能力就越強，因此余甘子葉總黃酮物質的浸出就越多；但超聲功率過大，“空化作用”過強，在一定程度會破壞一些黃酮物質的結構，影響總黃酮得率。與蘇適等[23]的研究結果類似。因此，超聲功率60 W最為合適。

2.1.4 提取溫度對余甘子葉總黃酮得率的影響 由圖4可知，余甘子葉總黃酮得率隨提取溫度的升高先增加后減小，當提取溫度為60 ℃時得率最大，為14.11%。適宜的溫度能促使溶劑分子加快運動，有利于總黃酮物質的溶解；溫度過高，乙醇揮發加劇，同時高溫導致部分不穩定的黃酮類成分發生分解反應，使得余甘子葉總黃酮得率下降，與楊麗維等[24-25]的研究結果一致。因此，提取溫度選擇60 ℃最為合適。

2.1.5 提取時間對余甘子葉總黃酮得率的影響 由圖5可知，余甘子葉總黃酮物質得率隨提取時間的延長先上升后下降。當提取時間為20 min時得率最大，為13.85%。說明超聲提取能在較短的時間里將余甘子葉總黃酮提取較為完全，提取時間越長，余甘子葉的其他活性成分也開始溶出，在一定程度上抑制了黃酮物質的溶出，同時，長時間的加熱和超聲使已溶出的黃酮物質水解或氧化，從而降低余甘子葉總黃酮得率。因此，提取時間選擇20 min最為合適。

圖3 超聲功率對余甘子葉總黃酮得率的影響

Figure 3 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

圖4 提取溫度對余甘子葉總黃酮得率的影響

Figure 4 Effect of extract temperature on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

圖5 提取時間對余甘子葉總黃酮得率的影響

Figure 5 Effect of extract time on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，在最佳提取溫度60 ℃下，選取料液比、乙醇濃度、超聲功率、提取時間進行四因素三水平正交試驗設計，因素水平表見表1，試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 余甘子葉總黃酮提取正交試驗結果

Table 2 Results of orthogonal experiment on extraction of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

試驗號ABCD總黃酮得率/%1111112.8212122213.9133133314.0954212313.5955223113.7316231214.3687313213.1858321313.4589332113.048k113.61013.20013.54913.200 k213.89813.70113.51913.822k313.23013.83713.67013.716R0.6680.6370.1510.622

由表2可知，各因素對余甘子葉總黃酮得率的影響大小依次為乙醇濃度>料液比>提取時間>超聲功率。由表3可知，料液比、乙醇濃度、提取時間對余甘子葉總黃酮的得率有顯著影響，而超聲功率無顯著影響。根據正交試驗結果，余甘子葉總黃酮的最佳提取工藝為A2B3C3D2，即料液比1∶25(g/mL)、乙醇濃度60%、超聲功率70 W、提取時間20 min、提取溫度60 ℃。對最佳提取工藝進行驗證(n=3)，余甘子葉總黃酮得率為14.565%，RSD值為0.476%，說明通過正交試驗得到的最佳工藝條件穩定可靠。

表3 正交試驗結果方差分析?

?F0.05(2,8)=4.46，F0.01(2,8)=8.62；*表示影響顯著(P<0.05)，**表示影響極顯著(P<0.01)。

2.3 余甘子葉總黃酮的抗氧化能力

2.3.1 對·OH的清除能力 由圖6可知，當余甘子葉總黃酮濃度為0.5 mg/mL時，清除率可達82.72%，此時的VC清除率為99.14%，說明余甘子葉總黃酮在較大濃度時具有很強的清除·OH的能力。

2.3.2 對DPPH·的清除能力 由圖7可知，當樣品濃度為0.08 mg/mL時，余甘子葉總黃酮和VC對DPPH·清除率分別為97.40%，97.58%，說明余甘子葉總黃酮具有很強的清除DPPH·的能力。

圖6 余甘子葉總黃酮對·OH的清除能力

Figure 6 The ·OH scavenging ability of total flavonoids in the leaves ofphyllanthusemblica

圖7 余甘子葉總黃酮對DPPH·的清除能力

Figure 7 The DPPH· scavenging ability of of total flavonoids in the leaves ofphyllanthusemblica

2.3.3 對NaNO2的清除能力 由圖8可知，當樣品濃度為0.5 mg/mL時，余甘子葉黃酮提取液和VC對亞硝酸鈉的清除率分別為66.14%，94.65%，說明余甘子葉黃酮具有一定的清除亞硝酸鈉的能力，但清除能力低于VC。

圖8 余甘子葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除能力

Figure 8 The NaNO2scavenging ability of of total flavonoids in the leaves ofphyllanthusemblica

3 結論

余甘子葉總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶25(g/mL)、乙醇濃度60%、超聲功率70 W、提取時間20 min、提取溫度60 ℃，此時提取率最大為14.57%。余甘子葉總黃酮對·OH、DPPH·以及NaNO2均具有一定的清除能力，當余甘子總黃酮提取液的質量濃度為0.5 mg/mL時，對·OH和NaNO2的清除率分別為82.72%，66.14%，當余甘子總黃酮提取液的質量濃度為0.8 mg/mL時，對DPPH·的清除率為97.40%，表明余甘子葉總黃酮具有較強的抗氧化能力。后續可對余甘子葉總黃酮進行進一步分離純化鑒定，確定單體并分析其功效作用，建立余甘子葉保健產品與黃酮活性成分的量效關系。