不同溫度對三葉蟲螢卵孵化和初孵幼蟲發育的影響

梅昭利，曹成全，童 超，劉方慶，徐丹陽

(樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614004)

作為一類著名的景觀昆蟲，螢火蟲在旅游和農業等領域具有重要的應用價值，其人工繁育研究和產業應用也逐步成為行業熱點(曹成全，2016，2019；陳政頤，2016；葉超，2016)。

三葉蟲螢EmeiapseudosauteriFu(Ballantyne &Lambkin,2012)隸屬于螢科Lampyridae峨眉螢屬Emeia，是發現于四川省樂山市峨眉山的新種，在四川省廣泛分布于樂山、峨眉、邛崍等地(Fuetal.,2012)。三葉蟲螢的基礎研究主要集中在該幼蟲和成蟲的形態特征、行為習性、生殖生理、棲境分析和夜間活動規律等方面(Fuetal.,2012;陳申芝等，2014；季現瑩，2014；盧聰聰等，2017；陳申芝等，2018；童超等，2018；陳鄭偉等，2019)。

由于成蟲起飛時間早、養殖較為容易等優點(陳申芝等，2014；盧聰聰等，2017)，三葉蟲螢目前成為人工繁育的優選種類。盧聰聰等(2017)研究了不同環境和介質對三葉蟲螢卵孵化的影響。本文研究了不同溫度對三葉蟲螢卵孵化和初孵幼蟲發育的影響，以期在豐富三葉蟲螢生物學資料的同時，為其人工繁育和產業化提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 蟲源及試驗材料

1.1.1成蟲選取

根據相關報道(陳申芝等，2014；童超等，2018)，成蟲選取地點位于四川省樂山市綠心公園(103°42′42.00″～103°45′10.57″E,29°33′44.37″～29°35′40.11″N)內的停耕農田，采集時間為3月中旬至4月中旬。

1.1.2成蟲處理

成蟲室內產卵環境模擬野外產卵介質，由下到上分別為濕潤土層、苔蘚層、蕨類植物層，然后噴水至苔蘚濕潤后放入成蟲，等待其交配產卵。當發現產卵，用鏟子連帶土和苔蘚一起取其卵塊，放入培養皿中分組處理。

1.1.3飼料

成蟲人工飼養時可用直徑約為0.5 cm的棉球蘸取5%蜂蜜水放入環境中代替野外露水，以確保其能正常生存和交配產卵。

1.1.4器材

經高壓滅菌處理的培養皿，恒溫培養箱(型號：鄭州生元儀器有限公司MGC-250H)，衛生紙，硫酸紙，滴管等。

1.2 方法

1.2.1孵化環境

以當天采集的土和苔蘚為孵化介質，加入少量濕潤衛生紙巾以保濕遮陰，濕度以其野外生存環境濕度為宜(介質濕度為40%，紙巾濕度約為50%)。將取回的卵隨機分配，每個培養皿中放入30粒。將濕潤的衛生紙鋪在卵粒上方，盡量減少對卵粒的移動和破壞。上述設置完成之后，將培養皿隨機分組，每組3個培養皿，分別標號為1、2、3，將分組后的培養皿分別放置到5個恒定溫度下和室內常溫條件下，其中12℃、15℃、20℃、25℃、30℃通過恒溫箱控制，控溫誤差在±1℃。在試驗期間，光照為12L ∶12D，空氣濕度約為90%。常溫組為室內自然通風條件且減少外界條件(如天敵傷害、自然強光、惡劣天氣、人為踐踏、重物沖擊、洪水等)對卵粒傷害以作為對照組，該組溫度隨自然溫度變化而變化，不作特殊處理；晝夜變化范圍16～28℃。

1.2.2孵化處理

每天定時檢查卵粒情況，并且對其噴水保濕。每次澆水量約為每個培養皿2 mL。觀察記錄卵粒發霉破碎、孵化等情況。

當出現卵粒孵化時，每天定時統計不同溫度下卵粒的孵化情況。待卵粒孵化完成后，統計其孵化率，以及20 d以內(20 d內三葉蟲螢幼蟲狀態不穩定，容易死亡)的存活率。

1.2.3幼蟲養殖

將同一天孵化出的幼蟲放在孵化溫度下進行養殖，且同一溫度下同一天孵化的幼蟲設為1組，并標明孵化日期和數量。將幼蟲直接放置在處理過的培養皿中，培養皿中放置1張折疊為0.5 mm的濕潤衛生紙，其濕度為50%。在投餌時根據其濕度情況適當澆水，以保持濕度，并且對其環境及時清理，1～3 d更換1次紙巾。

初孵幼蟲用處理好后剁碎的灰巴蝸牛Bradybaenaravida肉進行喂養(陳申芝等，2014；童超等，2018)，剁碎食物以每頭幼蟲提供0.1 g的量盛放在大小適宜的硫酸紙上，避免食物直接放置在其環境中，污染生存環境，影響實驗結果。幼蟲飼養每天投餌1次，投餌時間模擬野生三葉蟲螢進食時間，約為每天的17 ∶00-20 ∶00。

1.2.4數據記錄

觀察并記錄不同溫度下的孵化率和20 d內初孵化幼蟲的存活率。

1.3 計算方法

1.3.1直線回歸法(張孝羲，2002；郭昆等，2018)

用直線回歸法推算三葉蟲螢卵的發育起點溫度(℃)和有效積溫(K)，所有公式如下：

1.3.2直接最優法(David W，1986)

運用直接最優法計算三葉蟲螢卵的發育起點溫度(℃)和有效積溫(K)。該方法的基本原理是利用極值法，將理論有效積溫與實際測得的有效積溫誤差縮減到最小的目標上。理論算得的有效積溫和試驗測得的有效積溫的誤差極小為目標的目標函數，再用極值理論方法直接計算發育起點溫度(℃)，涉及公式為：

式中的Di為第i組處理溫度(Ti)下的發育歷期，T為溫度(℃)，i為處理數。

2 結果與分析

2.1 溫度對三葉蟲螢卵孵化的影響

室內變溫條件下(通風室內環境，溫度在16～28℃變化)每組卵的孵化率都高于96.00%，且個別組的孵化率為100%，平均孵化率達98.00%±1.57%，高于其他組別孵化率(P<0.001)。恒溫下12～25℃三葉蟲螢卵的孵化率隨著溫度的升高而降低；恒溫12℃下的孵化率是上述溫度中孵化率最高的1個，平均孵化率為94.44%±4.16%(n=3)；在恒溫15℃時的平均孵化率較高為92.22%±5.67%，個別組的孵化率達到100%；恒溫20℃下的平均孵化率為76.67%±7.20%，且在此溫度下孵化率的最大值為83.33%，最小值為66.67%；恒溫25℃下的孵化率普遍較低，平均孵化率只有44.44%±11.00%；恒溫30℃時，卵孵化率最低，平均孵化率僅有13.33%±1.62%(圖1)。

圖1 不同溫度下三葉蟲螢卵的平均孵化率Fig.1 Average hatching rates of Emeia pseudosauteri eggs under different temperatures注：不同小寫字母表示不同溫度下孵化率差異顯著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in hatching rates at different temperatures.

2.2 溫度對三葉蟲螢初孵幼蟲存活率的影響

溫度對三葉蟲螢初孵幼蟲的成活率影響顯著負相關(P<0.05)。不同溫度下，相同時間內孵化的幼蟲存活率差別很大：在開始孵化后的20 d內，溫度條件為15～30℃的初孵幼蟲存活率隨著溫度的升高而降低；恒溫12℃和30℃下初孵幼蟲難以生存，存活率為0%；25℃下初孵幼蟲的存活率僅為21.95%；20℃下初孵幼蟲的成活率為53.62%；15℃下初孵幼蟲的成活率73.17%(圖2)。

圖2 不同溫度下三葉蟲螢幼蟲存活率Fig.2 Survival rates of Emeia pseudosauteri larvae under different temperatures注：不同小寫字母表示不同溫度下存活率差異顯著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in survival rates at different temperatures.

2.3 溫度對三葉蟲螢卵發育歷期的影響

溫度對三葉蟲螢卵的發育歷期有顯著的影響。隨著溫度的升高，卵的發育歷期逐漸變短。在12℃下，卵的發育歷期達到42.96±1.49 d；在15℃下，卵的發育歷期達到33.47±1.87 d；在20℃下，卵的發育歷期達到24.05±0.32 d；在25℃下，卵的發育歷期為19.92±0.65 d；當溫度在30℃時，由于溫度過高，卵大部分發霉或損壞，少數能孵化，發育歷期為12.75±0.25 d(P<0.001)；常溫(16～28℃)條件下，卵的發育歷期為20.63±1.82 d，較恒溫25℃時的數值相差不大(圖3)。

圖3 不同溫度下三葉蟲螢卵的發育歷期Fig.3 Developmental duration of Emeia pseudosauteri eggs under different temperatures

2.4 三葉蟲螢卵的發育起點溫度和有效積溫

本研究根據運用直線回歸法和直接最優法推算出三葉蟲螢卵的發育起點溫度為5.71℃和3.52℃，算出了三葉蟲螢卵的有效積溫分別為328.78 d·℃和382.20 d·℃。兩種方法得出的發育起點溫度相差2.19℃，有效積溫相差了53.42 d·℃；直接最優法的變異系數c.v.(15.70%)，小于直線回歸法的變異系數(25.52%)，見表1。因此，對于三葉蟲螢卵的發育起點溫度和有效積溫，直接最優法的計算結果較直線回歸法更優。

表1 三葉蟲螢卵的發育起點溫度和有效積溫Table 1 The development zero and effective accumulated temperature of Emeia pseudosauteri eggs

3 結論與討論

本研究結果表明，溫度是影響三葉蟲螢卵孵化和生長發育的關鍵因素：溫度在室內常溫(16～28℃之間變化)情況下的孵化率最高，但其20 d內的存活率較低，且室內變溫條件不可控。在恒溫12～30℃范圍內，三葉蟲螢卵均能孵化，其孵化率隨溫度升高而降低，發育歷期也隨溫度升高而降低，發育速率隨溫度升高加快，且在高溫環境下，其孵化率不穩定。溫度對三葉蟲螢卵的孵化率的影響與溫度對小金蝠蛾卵孵化情況相似(涂永勤等，2011)，最適孵化溫度也相近，為恒溫15℃左右。

溫度對三葉蟲螢初孵幼蟲的存活率影響顯著。在15～25℃，初孵幼蟲的成活率隨著溫度的升高而降低。當溫度達到恒溫30℃時，初孵幼蟲無法長期生存，所有幼蟲在24～48 h內全部死亡。初孵幼蟲在恒溫15℃時存活率相對較高，20 d內的存活率達到73.17%；20℃下初孵幼蟲20 d內的存活率為53.62%，其它恒溫溫度和常溫條件下的存活率都較低；恒溫12℃時，由于溫度太低，初孵幼蟲無法長期在此溫度下生存，20 d內的存活率為0%。因此，溫度對三葉蟲螢初孵幼蟲的適溫范圍比較狹窄。

本研究中用直接最優法得到的三葉蟲螢卵的發育起點溫度為3.52℃，有效積溫為382.20 d·℃，回歸直線方程為T=3.52+382.20V，計算結果優于直線回歸法。

綜上所述，溫度顯著影響三葉蟲螢卵孵化、存活率和發育歷期。因此，人工繁育孵化時需考慮好溫度等條件。建議人工孵化溫度在恒溫15～20℃狀態下，初孵幼蟲養殖盡量避免超過30℃的高溫和低于12℃的低溫。