褐飛虱ABCB基因的克隆與表達分析

閘雯俊，李三和，周 雷，陳志軍，劉 凱，楊國才，徐華山，李培德，游艾青,2*

(1.湖北省農業科學院糧食作物研究所，糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.長江大學，主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，荊州 434025)

所有的細胞和細胞器都是通過脂質膜與外界環境分離的，需要轉運蛋白來轉運這些膜上的多種化合物(Higgins CF，1992)。以下事實證明了膜轉運的重要性：在大腸桿菌和人類中，約10%和4%的基因編碼轉運相關的蛋白(Blattneretal.,1997)。大多數ABC蛋白作為主要的活性轉運蛋白發揮作用，需要結合和水解ATP來轉運脂質膜上的底物，其轉運的底物包括糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質、細胞代謝產物和藥物等(王華丙等，2007)。ABC轉運蛋白最早發現于細菌，是細菌質膜上的一種具有運輸功能的ATP酶，由兩個結合和水解ATP的胞質核苷酸結合域(NBD)和兩個完整的跨膜域(TMD)組成。NBD域包含幾個保守序列，如Walker A (P-loop)、Walker B和特征基序C(吳轉斌和吳金美，2008)?？缒そY構域由5～6個跨膜螺旋組成，并提供底物特異性。功能性轉運體的4個結構域可以存在于一種蛋白質中，也可以分布在多種蛋白質上。在后者的情況下，ABC蛋白需要同二聚體或異二聚體來形成功能性ABC轉運體(Higgins and Linton，2004)。根據NBD的序列相似性，ABC蛋白家族被分為8個亞家族，用字母a～h表示。

褐飛虱Nilaparvatalugens屬同翅目飛虱科昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲之一，在中國長江流域和華南及西南廣大稻區發生頻繁、危害嚴重(王傳之等，2008)。本研究從褐飛虱體內分離得到ABCB基因，分析了ABCB基因的全長、結構，為研究褐飛虱ABCB基因的功能奠定了基礎。

RNA干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。高濃度的dsRNA才能保證靶標基因的連續抑制，利用體外合成的dsRNA來喂養昆蟲成本相對昂貴。HT115(DE3)菌株是一類特殊的RNase III缺陷型大腸桿菌菌株，可以飼喂線蟲，主要用于秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的RNAi干擾試驗。該菌株可以在LB或2YT培養基中正常生長，Tn10轉座子的存在使其具有四環素抗性。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(DE3區含有T7噬菌體RNA聚合酶，在IPTG存在時可誘導T7 RNA聚合酶大量表達，進而啟動線蟲dsRNA的表達)，可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，除了用于線蟲RNAi干擾試驗，也可用于pET系列、pGEX、pMAL等質粒的蛋白表達。利用大腸桿菌表達dsRNA已在粘蟲Mythimnaseparate(Ganbaataretal.,2017)中得以實現。

利用dsRNA喂養是目前最方便的方法之一，這種方法已經在從屬于7個目15種的昆蟲物種中實現了。通過喂養，對于腸道的靶標基因表現出極高的沉默效率。對于其他組織的靶標基因而言，RNAi的效率會因為靶標基因的不同和昆蟲種屬的不同而差別很大。例如蜜蜂Apismellifera脂肪體的基因，通過喂養會誘導90%的卵黃蛋白原表達下降(Nunes and Simoes,2009)；以及美洲散白蟻Reticulitermesflavipes調控Hexamerin儲存蛋白表達下降50%～70% (Zhouetal.,2008)；但是對于刺舌蠅Glossinamorsitans的鐵轉運蛋白沒有任何的效果(Walsheetal.,2009)。同時喂養效率也受昆蟲生長發育的影響。例如利用nitropin 2 dsRNA處理長紅錐蝽Rhodniusprolixus的4齡若蟲沒有效果，但利用2齡若蟲產生了42%的沉默效果(Araujoetal.,2006)。雖然利用dsRNA喂養的方法是非侵入性和方便的方法，不過喂養時dsRNA的攝取量和RNAi的效率會因為個體之間的差異而變得困難(Turneretal.,2006)。

因此，利用此技術通過人工喂養dsRNA沉默靶標而達到控制褐飛虱的目的。本研究通過構建NlABCB-dsRNA載體，轉化E.coliHT115后，經IPTG誘導，形成NlABCB-dsRNA，喂養褐飛虱后，褐飛虱靶標基因抑制，存活率下降。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料

褐飛虱品種為武漢大學飼養，飼養在感蟲水稻品種臺中1號TN1植株上，環境條件為25±2℃，相對濕度為80%，光照周期為L ∶D=16 ∶8。

1.1.2試劑

試驗所用大腸桿菌E.coliDH5α，ExTaq酶，逆轉錄試劑盒和pMD18-T克隆載體，5′-Full RACE和3′-Full RACE試劑盒購自Takara公司。引物合成及序列測定由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1總RNA的提取

采用TRIzol法抽提褐飛虱樣品的總RNA，具體操作參考Invitrogen公司TRIzol? reagent試劑說明書。

1.2.2cDNA克隆

利用赤擬谷盜Triboliumcastaneum的ABC transporter蛋白(GenBank登錄號:XP_971735.1)褐飛虱的ESTs數據庫(http://bphest.dna.affrc.go.jp/)中進行TBLASTN查詢，得到相應的相應EST片段。設計RACE外圍引物3′RACE outer和5′RACE outer以及內圍引物3′RACE inner和5′RACE inner。3′RACE和5′RACE模板的合成具體按照BDSMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual說明書步驟操作。利用巢式PCR技術分別擴增褐飛虱基因3′端和5′端?；虿樵兒诛w虱基因組，結合Augustus、FgeneSH等基因預測軟件分析，設計引物直接從兩端擴增全長cDNA。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測NlABCB轉錄差異

取-80℃保存不同生長發育時期褐飛虱和褐飛虱不同組織總RNA定量，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得褐飛虱的cDNA。在Roteogene 6000TM定量PCR儀(Corbett research)上進行10 μL體系的PCR反應，反應條件如下：94℃預變性2 min，然后以30～40個循環進行PCR擴增(94℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s)每個樣品3個重復，取平均值。以褐飛虱Actin作為參照基因，采用2-ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen，2001)，比較不同樣品基因表達水平。

1.2.4生物信息學分析

測序拼接獲得cDNA全長后，利用ExPASy Translate tool軟件(http://web.expasy.org/translate/)對翻譯得到相應cDNA編碼框進行預測，再利用下列在線工具進行蛋白質序列的功能域及結構域的預測：同源序列比對利用Clustalw(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)；進化樹圖的繪制利用MEGA 7.0軟件；分子量和等電點分析利用ExPASy Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)；二級結構的預測利用(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)。

1.2.5人工喂養dsRNA

取2齡褐飛虱若蟲用人工飼料作適應性預飼養，待若蟲發育至目標基因高表達階段，向人工飼料中添加dsRNA，每頭幼蟲喂養10 μg(1 μg/μL)dsRNA。RNA干擾設置2～3個濃度，同時設置空白對照組(純人工飼料)和dsGFP對照組(含dsGFP的人工飼料)。處理時，每飼喂裝置接入20頭發育一致的褐飛虱，設置3個重復。考察指標包括靶標基因表達量、個體存活率、生長發育狀況等。

2 結果與分析

2.1 褐飛虱NlABCB基因的克隆

以該EST序列為模板設計RACE引物，克隆得到NlABCB基因的5′cDNA片段和3′cDNA片段。5′cDNA序列長度約為0.9 Kb，3′cDNA序列長度約為0.8 Kb。全長序列經過測序拼接后，全長為1 468 bp，含有一個編碼153個氨基酸的開放開放閱讀框(圖1)。

2.2 NlABCB蛋白分析鑒定

NlABCB 基因編碼153個氨基酸。應用Computer pI/Mw Tool軟件(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析預測 NlABCB蛋白的分子量為16.8 kDa，等電點為8.8。二級結構預測分析發現，NlABCB 蛋白α螺旋占44.08%，延伸鏈占21.05%，β折疊占9.87%，隨機卷曲占25%(圖2)。

通過NCBI的Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序進行在線蛋白質序列比對，結果表明該基因與其它昆蟲的ABCB蛋白序列相似性大于72.54%(表2)。例如與灰飛虱Laodelphaxstriatella的同源性為93.42%，最高；與美洲鱟Limuluspolyphemus的同源性為72.54%，最低。由此可以看出褐飛虱 NlABCB 與其它昆蟲的ABC轉運蛋白序列相似性較高，其序列相當保守。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 NlABCB 的核苷酸和推測氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of NlABCB

表2 褐飛虱NlABCB基因與其它昆蟲NlABCB基因氨基酸相似性比較Table 2 Amino acid similarities of NlABCB gene of Nilaparvata lugens and other insects

2.3 褐飛虱 NlABCB 基因不同生長發育時期和組織的分析

為了解NlABCB基因在褐飛虱不同生長發育階段蟲體中和蟲體不同組織中的轉錄情況，分別提取1齡至5齡發育至24 h的若蟲和雌雄成蟲蟲體的總RNA以及5齡若蟲的中腸、唾液腺、脂肪體、表皮、腿和頭部組織的總RNA，利用實時熒光定量PCR法檢測該基因在褐飛虱不同發育階段蟲體中和不同組織的表達情況。試驗結果表明，該基因在雄成蟲的表達量較高(圖3)。在不同組織中，在中腸的表達量最高(圖4)。

圖3 NlABCB 基因在不同生長發育時期的表達Fig.3 Expression of NlABCB at different growth and development stages

圖4 NlABCB 基因在不同組織的表達分布Fig.4 Expression and distribution of NlABCB in different tissues

2.4 褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA的表達及其RNAi效果

以褐飛虱cDNA為模板，擴增褐飛風ABCB基因片段。Nco I和Sma I雙酶切L4440載體后，轉入菌株HT115后，IPTG便可表達dsRNA(圖5)。分別讓褐飛虱取食NlABCB-dsRNA進行RNAi。首先檢測褐飛虱取食dsRNA后，對其體內NlABCBmRNA表達水平的影響。結果發現：褐飛虱取食dsRNA后，第2天和第4天分別抑制了25%和48%。因此，人工喂養dsRNA可以抑制靶基因表達，效果顯著(圖6)。同時，褐飛虱取食dsRNA后，致死效果明顯。取食NlABCB-dsRNA后，其存活率顯著低于對照組，對照組和試驗組1 d、2 d、3 d、4 d的存活率分別為88.77%和86.67%、76.9%和70.78%、65.75%和55.67%、56.72%和46.69%。因此NlABCB基因可以進一步應用于褐飛虱抗蟲(圖7)。

圖5 褐飛虱 NlABCB 的dsRNA電泳圖Fig.5 The dsRNAs produced by the BPH NlABCB gene

圖6 褐飛虱取食dsRNA后 NlABCB mRNA的表達Fig.6 Expression of NlABCB mRNA in Nilaparvata lugens after feeding on dsRNA

圖7 褐飛虱取食dsRNA后存活率Fig.7 Survival rate of brown planthopper after feeding on dsRNA

3 結論和討論

ABCB亞家族由半個(HTS)和整個轉運體(FTS)組成。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中的ABCB-FTS已經被廣泛研究，MDR65(ABCB)通過創建血紅素屏障來對果蠅大腦進行化學保護(Mayeretal.,2009)，MDR49(ABCB)在生殖細胞遷移中起著至關重要的作用(Ricardo and Lehmann，2009)。此外，研究表明果蠅接觸到多環芳烴會誘導體內的ABCB FT/P-gfp表達(Vachetal.,2006)。同時給果蠅食物中添加含有0.1 mmol的抗葉酸藥物甲氨蝶呤后，在果蠅成蟲的馬氏管和腸道中，MDR49(ABCB)、MDR50(ABCB)的表達會顯著上調。另一方面，Broehan等人發現給蛹前期的赤擬谷盜注射ABCB- dsRNA后，赤擬谷盜的蛹成蟲期會有嚴重的發育缺陷，從而致死；同時卵巢不能產卵導致雌性不育(Broehanetal.,2013)。

最近的一些成功的例子表明dsRNA喂養可用于作為一種潛在的防治害蟲方式。Baum等通過篩選玉米根蟲DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte 的cDNA文庫鑒定了290個編碼重要蛋白的靶標基因，發現52 ng/cm2濃度的dsRNA可以產生明顯的死亡率和發育遲緩(Baumetal.,2007)。通過取食獲得RNAi的效果已在多種昆蟲中得以實現，如蘋果褐卷蛾Pandemisheparana(Turneretal.,2006)，美洲散白蟻(Zhouetal.,2008)，長紅錐蝽(Araujoetal.,2006)等當中都有發現，所以這已經成為一種控制害蟲的新方法。

本研究克隆得到NlABCB基因的全長，并且將氨基酸序列與其他昆蟲的ABCB進行序列比對，發現與灰飛虱、濕木白蟻的ABCB蛋白在進化上親緣關系較近。并且對褐飛虱ABCB蛋白序列分析發現，該蛋白α螺旋占44.08%，延伸鏈占21.05%，β折疊占9.87%，隨機卷曲占25%。同時鑒定了NlABCB基因在褐飛虱不同生長發育階段蟲體中和蟲體不同組織中的轉錄情況，該基因在雌性成蟲的表達量較高。在不同組織中，在中腸的表達量最高。中腸組織是昆蟲腸道組織中唯一與細胞表面直接接觸的。同時有研究表明家蠶Bombyxmori中的ABCB基因是特異表達的，在蛻皮和化蛹期間受20E正調節(Liuetal.,2011)。同時構建L4440-NlABCB的dsRNA載體，轉化E.coliHT115后，經IPTG誘導，形成NlABCB-dsRNA,喂養褐飛虱取食含NlABCB-dsRNA人工飼料，發現褐飛虱的存活率明顯降低。

因此，褐飛虱NlABCB基因的表達特征表明，利用農藥防治褐飛虱的最佳時期是在早齡期。這些結果可能有利于開發一些以NlABCB基因為靶標的安全有效的殺蟲劑，同時可以利用RNA干擾的方法來抑制ABC轉運蛋白的表達，達到控制害蟲的目的。