電子煙煙霧氣體染毒對C57BL/6小鼠腸道菌群的影響

劉麗娟 郭紫薇 陳晶澤

摘要：目的 ?分析電子煙煙霧氣體染毒對C57BL/6小鼠腸道菌群的影響。方法 ?將60只7周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為電子煙12 mg尼古丁組，電子煙0 mg尼古丁組，空氣對照組（陰性對照組），傳統煙組（陽性對照組）4組，每組15只。使用一種仿生模擬人體呼吸系統吸煙的生發裝置對C57BL/6小鼠進行染毒，并對糞便基因組DNA提取及細菌16S rDNA擴增子測序，分析電子煙煙霧染毒對腸道菌群α多樣性、β多樣性、腸道菌群在門、屬水平的影響及其對腸道菌群群落組成及結構的影響。結果 ?煙霧染毒后電子煙組（電子煙12 mg尼古丁組，電子煙0 mg尼古丁組）腸道微生物α多樣性多于空氣對照組，β多樣性少于空氣對照組，擬桿菌門和乳桿菌的豐富度低于空氣對照組，厚壁菌門和Alistipes的豐富度高于空氣對照組;電子煙12 mg尼古丁組擬桿菌屬的豐富度低于空氣對照組，而電子煙0 mg尼古丁組擬桿菌屬的豐富度高于空氣對照組;PCA分析結果顯示，各電子煙組與同期空氣對照組群落組成存在差異;UPGMA聚類分析結果顯示，電子煙組與空氣對照組相比腸道菌群群落結構發生改變，電子煙組（電子煙12 mg尼古丁組與電子煙0 mg尼古丁組）菌群結構較為相似，而與空氣對照組的相似度卻較低。結論 ?電子煙煙霧染毒會對小鼠腸道菌群產生影響，從而導致實驗小鼠腸道菌群失調，且煙霧染毒對小鼠腸道菌群產生影響的成分可能不只是尼古丁，其他非尼古丁化學物質同樣可能造成腸道菌群的失調。

關鍵詞：電子煙;煙霧染毒;腸道菌群;菌群失調;致病因子

中圖分類號：TS458;R363 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.06.027

文章編號：1006-1959（2020）06-0072-04

Abstract：Objective ?To analyze the effect of e-cigarette smoke gas exposure on the intestinal flora of C57BL/6 mice. Methods ?Sixty 7-week-old male C57BL / 6 mice were randomly divided into an e-cigarette 12 mg nicotine group， an e-cigarette 0 mg nicotine group， an air control group （negative control），traditional smoke group （positive control group） 4 groups， 15 in each group. C57BL/6 mice were infected with a hair growth device that mimicked smoking in the human respiratory system， and fecal genomic DNA extraction and bacterial 16S rDNA amplicon sequencing were performed to analyze the e-cigarette smoke exposure to the intestinal flora α Effects of β-diversity， intestinal flora on the genus level and its effect on the composition and structure of intestinal flora.Results ?After smoke exposure， the e-cigarette group （e-cigarette 12 mg nicotine group， e-cigarette 0 mg nicotine group） had more intestinal microbial α diversity than air control group， β diversity less than air control group， Bacteroides and Lactobacillus The richness is lower than that of the air control group， and the abundance of Pachyphyte and Alistipes is higher than that of the air control group; the richness of Bacteroides in the 12 mg nicotine group of e-cigarettes is lower than that in the air control group， and that of 0 mg nicotine group in e-cigarettes Genus richness is higher than the air control group; PCA analysis results show that there is a difference in community composition between the e-cigarette group and the air control group over the same period; UPGMA cluster analysis results show that the intestinal flora community structure of the e-cigarette group compared with the air control group the e-cigarette group （e-cigarette 12 mg nicotine group and e-cigarette 0 mg nicotine group） had a similar flora structure， but the similarity with the air control group was lower.Conclusion ?The e-cigarette smoke exposure will affect the intestinal flora of mice， which will cause the intestinal flora of experimental mice to be imbalanced， and the components of smoke intoxication that may affect the intestinal flora of mice may not be only nicotine， other non- nicotine chemicals can also cause imbalances in the intestinal flora.

Key words：Electronic cigarette;Smoke exposure;Intestinal flora;Flora imbalance;Pathogenic factors

腸道微生物群是一個多樣化的菌群[1]，與宿主免疫存在雙向關系[2]，在宿主免疫的發展是由微生物群介導宿主免疫的同時也不斷受到宿主免疫的調節。腸道微環境是由腸道微生物群落及其代謝產物（短鏈脂肪酸等）和腸粘膜免疫系統形成的，在機體健康狀態下通常處于動態平衡狀態。腸道微生物已成為影響人類健康和疾病的核心因素，其多樣性的喪失與人類和其他哺乳動物中的各種胃腸道和全身性疾病相關[6]。腸道菌群是腸道微環境的重要組成部分，因此，保證腸道菌群的動態平衡至關重要[3]。多種因素包括環境化學物質均可對腸道菌群造成影響，導致各種動物的腸道微生物群破壞，稱為腸道菌群失調[4]。而任何腸道菌群構成的改變都叫微生物群失調。吸煙是影響人腸道微生物群組成的重要環境因素[5]。因此腸道菌群所參與的各類代謝途徑和環節可對機體的各個系統和組成環境造成不同程度的影響，可能成為很多疾病發生發展的危險因子。電子煙又名電子尼古丁傳送系統，通過電池加熱使得煙油高溫霧化吸入人體，以模仿吸食卷煙的過程，其在使用過程中是否會造成機體腸道菌群失調尚不清楚，本研究使用一種仿生模擬人體呼吸系統吸煙的生發裝置對C57BL/6小鼠進行染毒，并對糞便基因組DNA提取及細菌16S rDNA擴增子測序分析，探討電子煙煙霧氣體染毒對C57BL/6小鼠腸道菌群的可能影響，現報道如下。

1材料和方法

1.1實驗動物與分組 ?60只7周齡雄性C57BL/6小鼠，SPF級別，常規喂養，體重（20±2）g，購自空軍軍醫大學（原第四軍醫大學）實驗動物中心，合格證：SYXK（陜）2016-005，自由獲取食物和水，12 h光照和12 h黑暗循環，環境溫度（21±2）℃，濕度（50%±10%）。小鼠適應性喂養1周，從第2周開始進行煙霧染毒，連續4周。將小鼠采用隨機數字表法分為4組，每組15只，每籠5只，分別為電子煙12 mg尼古丁組，電子煙0 mg尼古丁組，空氣對照組（陰性對照組），傳統煙組（陽性對照組）。

1.2方法

1.2.1煙霧染毒 ?通過使用本研究團隊授權獲批的 發明專利裝置：一種仿生模擬人體呼吸系統吸煙的生發裝置（專利號：ZL201721438419.0）將煙氣氣體傳送至靜式染毒柜（型號8050-1，天津開發區合普工貿有限公司）染毒。根據實驗動物體重以及體表面積的指標計算，確定染毒時間和頻次：按照8點，14點，20點三個時間段進行煙氣染毒，3次/d，30 min/次，持續染毒4周。用鼠體表面積與正常成年人體表面積進行換算，根據每人20支/d的吸煙量計算得出實驗用鼠每天進行煙氣染毒所消耗的傳統卷煙數量和頻次;并根據傳統煙陽性對照的尼古丁消耗，等量計算出電子煙煙油的消耗量，染毒持續的時間保持一致，進行電子煙的煙氣染毒。以人的平均年齡與小鼠的平均年齡換算，小鼠染毒4周，相當于人吸煙達到5年以上。根據Meeh-Rubner氏公式計算得出本次實驗煙霧染毒的濃度為6.19%。實驗使用的染毒倉體積為100 L，小鼠30 min內吸取的煙氣量為100 L×6.19%=6.19 L（約需要2支香煙），根據傳統煙組的煙氣尼古丁量，對等使用相同含量的電子煙12 mg尼古丁。本實驗使用同一型號的靜式染毒柜，保證染毒倉的體積大小相等。每次實驗嚴格按照計算的傳統煙支數，電子煙煙液量進行實驗煙霧染毒。負責染毒的實驗人員提前培訓，統一染毒標準且在整個染毒過程中負責染毒的實驗人員固定不變。保證產生煙霧染毒型小鼠同時保證每次煙霧染毒時煙霧濃度一致。

1.2.2糞便基因組DNA提取及細菌16S rDNA擴增子測序 ?①糞便基因組DNA的提取：根據制造商說明書使用糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取，樣本送測序公司檢測。②PCR擴增：利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，選擇16S V4區引物（515F和806R）， Phusion ?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶（New England Biolabs）進行PCR。③PCR產物的混樣和純化：PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產物，剪切回收目標條帶。使用產物純化試劑盒即GeneJET 膠回收試劑盒（Thermo Scientific）回收產物。④文庫構建和上機測序：使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒（Thermofisher）進行文庫的構建，將構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用的Ion S5TMXL（Thermofisher）進行上機測序。

1.3觀察指標 ?①電子煙煙霧染毒對腸道菌群α多樣性、β多樣性以及腸道菌群在門、屬水平的影響;②電子煙煙霧染毒對腸道菌群群落組成的影響;③電子煙煙霧染毒對腸道菌群群落結構的影響。

1.4統計學方法 ?①測序數據處理：使用Cutadapt（V1.9.1，）對reads進行低質量部分剪切，再根據16S V4區引物初步質控得到原始數據（Raw reads）并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據（Clean Reads）。②使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算ACE，組間差異分析行參數檢驗和非參數檢驗，多組比較采用Tukey檢驗和agricolae包的wilcox檢驗。③Beta多樣性組間差異分析的箱形圖可以直觀的反應組內樣本相似性的中位數，離散程度，最大值，最小值，異常值。④組間物種Beta多樣性采用 wilcox秩和檢驗。⑤使用R軟件（Version 2.15.3）繪制PCA圖。PCA分析使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包。⑥用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Unifrac距離、構建UPGMA樣品聚類樹。

2結果

2.1電子煙煙霧染毒對腸道菌群α多樣性、β多樣性以及腸道菌群在門、屬水平的影響 ?煙霧染毒4周結果分析顯示電子煙組腸道微生物組α多樣性多于空氣對照組（圖1），β多樣性少于空氣對照組（圖2）;電子煙組的擬桿菌門和乳桿菌的豐富度低于空氣對照組，厚壁菌門和Alistipes的豐富度高于空氣對照組（圖3A、圖3B）。電子煙12 mg尼古丁組擬桿菌屬的豐富度低于空氣對照組，而電子煙0 mg尼古丁組擬桿菌屬的豐富度高于空氣對照組（圖4A、圖4B）。

2.2電子煙煙霧染毒對腸道菌群群落組成的影響 ?PCA分析結果顯示各電子煙組與同期空氣對照組群落組成存在差異。第一主成分對各組群落結構差異的貢獻值為14.38%，第二主成分對各組差異的貢獻值為9.85%，（見圖5）。

2.3電子煙煙霧染毒對腸道菌群群落結構的影響 ?UPGMA聚類分析結果顯示電子煙組與空氣對照組相比腸道菌群群落結構發生改變，電子煙組（電子煙12 mg尼古丁組與電子煙0 mg尼古丁組）菌群結構較為相似，而與空氣對照組的相似度卻較低，見圖6。

3討論

本研究結果顯示，電子煙組（電子煙12 mg尼古丁，電子煙0 mg尼古丁）煙霧染毒4周會使腸道微生物組α多樣性，β多樣性及門、屬的豐富度與同期空氣對照組相比發生顯著變化，對小鼠腸道菌群群落組成及群落構成產生影響，從而引起小鼠腸道菌群失衡。有研究表明[7]，乳桿菌會降低血脂含量（如膽固醇和甘油三酯），腸道微生物可以通過多種直接和間接的生物學機制影響宿主脂質代謝。本研究結果顯示，12 mg尼古丁組、電子煙0 mg尼古丁組的乳桿菌屬豐富度與空氣對照組相比都有所降低。由此推測煙霧暴露使得乳桿菌屬豐富度降低從而降低了宿主降低血脂的能力使得宿主TC、TG增加，可能增加心血管疾病的風險。

PCA分析結果顯示，電子煙組、傳統煙組與空氣對照組均存在差異，說明傳統煙、電子煙12 mg尼古丁，電子煙 ? ?0 mg尼古丁都會對腸道菌群的平衡產生一定影響，推測包括尼古丁在內的電子煙中的化學物質都會對腸道菌群產生影響。

此外，電子煙組與空氣對照組相比腸道菌群結構都有所改變，且空氣對照組與傳統煙組菌群結構較為相似，電子煙12 mg尼古丁組與電子煙0 mg尼古丁組菌群結構較為相似。由此推測煙霧染毒對小鼠腸道菌群產生影響的成分不只是尼古丁，電子煙中的非尼古丁化學物質同樣可能造成腸道菌群的失調，甚至電子煙12 mg尼古丁和電子煙0 mg尼古丁中的非尼古丁化合物對腸道菌群影響可能超過尼古丁，但具體機制尚不清楚，今后需要繼續針對電子煙 ? ? 12 mg尼古丁、電子煙0 mg尼古丁對腸道菌群影響機制進行研究以及分離出傳統煙、電子煙12 mg尼古丁、電子煙0 mg尼古丁中的有效成分，進一步分析導致腸道菌群的失調的具體成分。

參考文獻：

[1]Barko PC，McMichael MA，Swanson KS，et al.The Gastrointestinal Microbiome：A Review[J].J Vet Intern Med，2018，32（1）：9-25.

[2]Koliada A，Syzenko G，Moseiko V，et al.Association between body mass index and Firmicutes/Bacteroidetes ratio in an adult Ukrainian population[J].BMC Microbiol，2017，17（1）：120.

[3]Lin L，Zhang J.Role of intestinal microbiota and metabolites on gut homeostasis and human diseases[J].BMC Immunol，2017，18（1）：2.

[4]Nie YF，Hu J，Yan XH.Cross-talk between bile acids and intestinal microbiota in host metabolism and health[J].J Zhejiang Univ Sci B，2015，16（6）：436-446.

[5]Biedermann L，Zeitz J，Mwinyi J，et al.Smoking cessation induces profound changes in the composition of the intestinal microbiota in humans[J].PLoS One，2013，8（3）：e59260.

[6]van de Wouw M，Boehme M，Lyte JM，et al.Short-chain fatty acids： microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations[J].J Physiol，2018，596（20）：4923-4944.

[7]Power SE，O'Toole PW，Stanton C，et al.Intestinal microbiota，diet and health[J].Br J Nutr，2014，111（3）：387-402.

收稿日期：2019-11-29;修回日期：2020-01-17

編輯/肖婷婷