關于腫瘤Wnt信號通路棕櫚酰化的綜述

姜風琳 丁明

摘? 要：Wnt信號通路是一條進化上保守的信號通路，可以調節胚胎形成和組織發育等一系列生命過程。WNT蛋白可通過棕櫚酰化進行翻譯后修飾，對調節WNT蛋白在細胞中的分泌、定位、生物活性和從產生細胞中擴散起著關鍵作用。Wnt信號調控失衡與人類癌癥的發生密切相關，但具體的機制仍不清楚。文章將從Wnt信號途徑轉導的分子機制、porcupine（Porcn）介導的WNT蛋白的棕櫚酰化以及Wnt信號通路在腫瘤中的功能進行探討。

關鍵詞：Wnt信號通路;棕櫚酰化;porcupine;腫瘤

Abstract： Wnt signal pathway is an evolutionarily conserved signal pathway， which can regulate a series of life processes such as embryonic formation and tissue development. WNT protein can be post-translational modified by palmitoylation， which plays a key role in regulating the secretion， localization， biological activity and diffusion of WNT protein in cells. The imbalance of Wnt signal regulation is closely related to the occurrence of human cancer， but the specific mechanism is still unclear. In this paper， we will discuss the molecular mechanism of Wnt signal transduction， the palmitoylation of WNT protein mediated by porcupine （Porcn） and the function of Wnt signal pathway in tumor.

前言

作為一種進化上高度保守的信號通路，Wnt信號通路在機體生長、發育、代謝和干細胞維護等生物過程中發揮重要作用，相關研究發現Wnt信號通路失調與癌癥等惡性疾病密切相關[1]。在Wnt信號中，分泌的Wnt配體家族成員與一系列細胞表面受體結合，刺激產生了不同的信號級聯，包括典型Wnt途徑（β-catenin依賴途徑）與平面細胞極性通路PCP、Wnt/Ca2+通路的非典型Wnt途徑（β-catenin獨立途徑）[2]。Wnt受體、下游信號轉導通路和靶向通路已經被廣泛研究，但是對WNT蛋白如何分泌、如何從分泌Wnt的細胞向接收細胞轉移的研究還很少。目前，已經知道內質網上的多跨膜O-酰基轉移酶Porcn可以指導Wnt蛋白的分泌、成熟和棕櫚酰化。在這篇綜述中，我們總結并討論了當前對Wnt酰化的理解，以便為將來該領域的研究提供借鑒。

1 Wnt信號通路

1982年人類首次從小鼠乳腺癌中分離得到wnt基因（也稱int-1，小鼠乳腺癌病毒整合位點1）[3]。小鼠和人均編碼19個wnt基因，不同的wnt基因具有特定的表達模式和功能。Wnt信號通路由WNT蛋白、β-catenin等多種信號分子、配體和受體組成，在進化過程中具有保守性。人類WNT家族由19個富含半胱氨酸的分泌糖蛋白組成，長度為350-400個氨基酸，有15個以上的受體或共受體作為配體[4]。

1.1 經典Wnt通路

破壞復合物（destruction complex）由AXIN、腫瘤抑制性腺瘤性息肉蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3（GSK-3）和酪蛋白激酶1（CK1）組成。在沒有經典WNT配體的情況下，β-catenin結合到破壞復合物上并被CK1和GSK-3磷酸化，磷酸化后的β-catenin經蛋白泛素化被蛋白酶體降解[5]。但在經典WNT配體的存在下，β-catenin的磷酸化和蛋白酶體降解會被抑制。當WNT配體與FZD受體/LRP共受體結合時，穩定β-catenin的破壞復合物被分解，DVL蛋白結合至AXIN，而后AXIN可抑制破壞復合物中GSK-3磷酸化β-catenin，因此破壞復合物被招募到質膜上形成信號體[6]。β-catenin在細胞質中聚集并定位到細胞核，與DNA結合T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）轉錄因子形成核復合體，導致Wnt應答基因的激活。

1.2 非經典Wnt通路

與β-catenin依賴的典型途徑相比，WNT蛋白質能夠激活獨立于β-catenin以外的信號通路，這些通路被稱為非經典通路，可以進一步分為兩條不同的路徑分支即平面細胞極性（PCP）通路和Wnt/Ca2+通路。

PCP通路參與細胞形態發生過程中極性的調控[7]。PCP途徑通過WNT配體與FZD受體的結合激活通路，而與LRP共受體無關。非經典途徑不需要利用包括Wnt本身在內的大多數經典途徑組份，但大多數都涉及DVL和Dvl相關形態發生激活子1（DAAM 1）。在Wnt/PCP信號途徑中，Wnt5A激活DVL、JNK和Rho。FZD和DVL與小GTP酶Rho連接，Rho進一步激活Rho相關激酶（ROCK），從而導致細胞骨架重組。Dvl與Rac GTP酶形成復合體，激活了Jun激酶（JNK）的活性[8]。非經典Wnt信號的第二個分支稱為Wnt/Ca2+途徑。Wnt/Ca2+途徑的作用是調節細胞內Ca2+從內質網中的釋放，并在原腸胚形成過程中調節背軸形成信號激活原腸胚細胞運動、細胞粘附、遷移[9]。Wnt/Ca2+途徑的激活需要WNT配體與FZD受體結合，直接相互作用并激活異源三聚體G蛋白，導致細胞內Ca2+濃度增加。釋放的Ca2+然后可以激活鈣/鈣調蛋白依賴激酶II（CamKII）、鈣調磷酸酶或蛋白激酶C（PKC）[10]。

2 棕櫚酰化

棕櫚酰化是將16碳飽和脂肪酸棕櫚酸酯作為脂質供體連接在蛋白質的一個或多個半胱氨酸殘基上（但有時作為一個氧酯附著到絲氨酸）[11]。棕櫚酰化不僅可以通過與其他蛋白質的相互作用，將信號分子正確引導到細胞內和細胞間的靶點;還可以通過膜錨定在特定的細胞表面微域/脂質受體，促進信號傳遞的效率和特異性。

2.1 Porcn介導WNT蛋白棕櫚酰化

Wnt蛋白必須經過加工和分泌才能發揮作用。WNT蛋白上的棕櫚酰化修飾是由位于細胞內質網上的Porcn進行的。WNT蛋白通過棕櫚酰化附著至脂質體，繼而被輸送至細胞質膜完成分泌過程。Wnt細胞外轉運的具體機制仍待繼續研究，這些可能涉及分泌小泡或外泌體結合。負責棕櫚酰化修飾的Porcn是定位于內質網（ER）的膜結合O酰基轉移酶（MBOAT）家族中的成員，是一種多次跨膜蛋白[12]。

Porcn催化的反應發生在內質網腔中，分兩步進行。首先，Porcn催化脂肪酰化反應需要硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1），SCD1的去飽和作用可以將棕櫚酰輔酶A變成棕櫚油酸輔酶A。然后，棕櫚油酸輔酶A是Porcn的底物，Porcn將棕櫚油酸輔酶A轉移到WNT蛋白的半胱氨酸上，催化反應發生[13]。Porcn可以將13-16個碳的單不飽和脂肪酸連接到WNT蛋白上。盡管已經確定了Porcn具有Wnt酰基轉移酶的作用，但目前尚不清楚Porcn是如何識別其脂肪酸底物的以及為什么WNT蛋白發揮功能需要進行棕櫚酰化反應。

2.2 WNT蛋白的分泌需要棕櫚酰化

棕櫚酰化位點的半胱氨酸突變會導致脊椎動物和果蠅WNT蛋白活性的顯著喪失和重新分布。Wntless是一種細胞內跨膜蛋白，通過促進Wnt從高爾基向質膜的運動來促進WNT蛋白的分泌。93位的棕櫚酰化是果蠅Wingless（WG）蛋白分泌所必需的，在沒有Porcn或棕櫚酰化位點的情況下，WG蛋白在內質網中累積但不會分泌。WG的C93A突變體在內質網中積累，表明棕櫚酰化對WG的細胞內運輸和分泌是必要的。用蛋白棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸鹽處理果蠅S2細胞抑制棕櫚酰化作用后，也能阻斷WG蛋白向培養基中的有效分泌。未棕櫚酰化的WG蛋白分泌減少可能導致蛋白錯誤折疊以及在內質網中累積。棕櫚酰化對WG蛋白分泌的影響可能是由于它能夠使WG在高爾基體內形成脂質筏膜微結構域，并且優先輸送到質膜。在沒有Porcn的情況下，突變的WG的第一個半胱氨酸殘基具有一個游離的巰基，可能會干擾其他半胱氨酸的正常二硫鍵形成，從而導致蛋白質錯誤折疊并保留下來。WG中大量的半胱氨酸使錯誤折疊成為應對錯義突變的常見反應[14]。

2.3 WNT蛋白受體的激活需要棕櫚酰化

棕櫚酰化可以增強某些配體蛋白的信號活性。在培養的細胞中加入等量的非棕櫚酰化WNT3A蛋白與其棕櫚酰化形式相比，前者的活性顯著降低。野生型和WNT3A的C77A突變型（一種非棕櫚酰化突變體）均能從穩轉細胞的條件培養基中有效地檢測到。然而，WNT3A的C77A 突變型導致其與受體LRP6和Frizzled 8的結合能力受損[15]。小鼠WNT3A的棕櫚酰化位點的突變不影響其分泌，但減少了其活性，這揭示了WNT棕櫚酰化的第二種功能。

2.4 棕櫚酰化對轉運有不同的影響

除了影響分泌和信號活性外，WNT/WG蛋白的棕櫚酰化也影響細胞外轉運過程。通過體外過表達Porcn能增強雞神經管中Wnt1或Wnt3a的棕櫚酰化作用，使Wnt信號梯度變陡，這可能是阻止蛋白從分泌部位向外擴散引起的。WG蛋白與載脂蛋白共同存在時，棕櫚酰化促進WG與脂蛋白顆粒結合。一旦與脂蛋白顆粒結合，WG就能夠在較長的距離上運動并發出信號[16]。

3 Wnt信號通路與腫瘤

腫瘤是一類由于基因、表觀遺傳和細胞水平的逐步改變而持續增殖的疾病，已成為人類健康的巨大威脅。Wnt途徑的突變和功能失調與癌癥有著密切的聯系，Wnt途徑的組成部分本身可能起促癌或抑癌作用。Wnt/β-catenin信號通路參與多種人類腫瘤的發生，已成為近年來的研究熱點。

APC基因的截斷突變和結直腸癌有關。在約90%的結直腸癌中，Wnt通路的一個組成部分的激活突變導致結直腸癌的形成，其中80%的突變位于APC上，大多是發生了功能喪失或截斷突變[17]。沒有活性的APC突變會導致Wnt通路的不適當激活，而APC突變通常是發生在結直腸癌中。APC突變是結直腸癌中Wnt信號的主要驅動因素，這些APC突變經常發生在突變簇區域，該區域僅占整個編碼區的10%[18]。與結直腸癌不同，乳腺癌在β-catenin的任何編碼基因或破壞復合物的組分中都沒有表現出基因改變[19]。乳腺癌中Wnt通路的激活似乎是由分泌的Wnt配體的表達以及可溶性Wnt抑制劑表達下降引起的[20]。

在肝細胞癌中，β-catenin的積累與低分化形態、高增殖活性和不良預后有關。肺癌中的Wnt信號也與轉移能力的增加有關[21]。肝癌中激活的Wnt突變發生在負調節蛋白AXIN中[22]，AXIN作為β-catenin水平和腫瘤抑制蛋白的負調節因子，AXIN的過度表達抑制肝癌細胞的生長[23]。此外，PKC激活的增加已被證明可以增加黑色素瘤細胞的遷移，而其抑制能夠減少黑色素瘤轉移和黑色素瘤細胞運動[24]。在黑色素瘤細胞中PKC的激活導致STAT3的激活，從而抑制一些黑色素瘤分化抗原的表達，從而降低了黑色素瘤細胞的免疫原性[25]。

4 結束語

Wnt信號通路是抗腫瘤治療的潛在靶點，靶向Wnt信號通路抑制癌癥一直是一個研究熱點，多種相關的抑制劑已經進入臨床實驗。同時Wnt信號通路在免疫調節中的功能，也提示靶向該信號通路可能在腫瘤免疫治療中發揮重要作用。Wnt信號通路一直被認為是很有希望的腫瘤治療靶標，第一個Wnt信號通路抑制劑的臨床試驗正在進行。在腫瘤特別是肝癌發生過程中，APC和β-catenin等下游成分頻繁發生突變，許多藥物開發工作最初集中在阻斷β-catenin/Tcf復合物的活性上。細胞信號通路之間的應答及信號通路網絡的研究，對于更精準地靶向治療策略尤為重要，因此詳細研究Wnt信號通路的調控機理、翻譯后修飾對Wnt信號通路的調節機制和Wnt信號通路異常在腫瘤發生和發展過程中的功能，都是目前仍待解決的問題。但隨著該領域研究的深入進行，將有助于開發出更多新穎的治療策略或化合物。

參考文獻：

[1]Tammela T， Sanchez-Rivera FJ， Cetinbas NM， et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 2017，545（7654）：355-359.

[2]Habas， R.; Dawid， I.B. Dishevelled and Wnt signaling： Is the nucleus the final frontier？ J. Biol. 2005，4，2.

[3]Lee SY， Jeon HM， Ju MK， et al. Wnt/Snail signaling regulates cytochrome C oxidase and glucose metabolism. Cancer Res. 2012，72（14）：3607-3617.

[4]Sharma， R.P.; Chopra， V.L. Effect of the Wingless（wg1） mutation on wing and haltere development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 1976，48：461-465.

[5]He， X.; Semenov， M.; Tamai， K.; Zeng， X. LDL receptor-related proteins 5 and 6 in Wnt/beta-catenin signaling： Arrows point the way. Development， 2004，131：1663-1677.

[6]Bili ， J.; Huang， Y.-L.; Davidson， et al. Wnt Induces LRP6 Signalosomes and Promotes Dishevelled-Dependent LRP6 Phosphorylation. Science， 2007，316：1619.

[7]Matsui， T.; Raya， A.; Kawakami， et al. Noncanonical Wnt signaling regulates midline convergence of organ primordia during zebrafish development. Genes Dev. 2005，19：164-175.

[8]Veeman， M.T.; Axelrod， J.D.; Moon， R.T. A second canon. Functions and mechanisms of beta-catenin-independent Wnt signaling. Dev. Cell 2003，5：367-377.

[9]Kohn， A.D.; Moon， R.T. Wnt and calcium signaling： Beta-catenin-independent pathways. Cell Calcium 2005，38：439-446.

[10]Fan G， Ye D， Zhu S， et al. RTL1 promotes melanoma proliferation by regulating Wnt/β-catenin signalling. Oncotarget， 2017，8：106026-106037.

[11]Resh MD. Palmitoylation of ligands， receptors， and intracellular signaling molecules. Sci. STKE. 2006：14.

[12]Nile AH， Hannoush RN. Fatty acylation of Wnt proteins. Nat Chem Biol. 2016，12（2）：60-9.

[13]X. Gao， R.N. Hannoush. Single-cell imaging of Wnt palmitoylation by the acyltransferase porcupine.Nat. Chem. Biol.， 2014（10）：61-68.

[14]Rios-Esteves J， Resh MD. Stearoyl CoA desaturase is required to produce active， lipid-modified Wnt proteins. Cell reports. 2013，4（6）：1072-81.

[15]Franch-Marro X， Wendler F， Griffith J， Maurice MM， Vincent JP. in vivo role of lipid adducts on Wingless. J. Cell Sci. 2008，121：1587-1592.

[16]Komekado H， Yamamoto H， Chiba T， Kikuchi A. Glycosylation and palmitoylation of Wnt-3a are coupled to produce an active form of Wnt-3a. Genes Cells. 2007，12：521-534.

[17]Panakova D， Sprong H， Marois E， Thiele C， Eaton S. Lipoprotein particles are required for Hedgehog and Wingless signalling. Nature. 2005，435：58-65.

[18]Polakis P. Wnt signaling and cancer. Genes Dev. 2000，14：1837-1851.

[19]Sparks AB， Morin PJ， Vogelstein B， Kinzler KW. Mutational analysis of the APC/beta-catenin/Tcf pathway in colorectal cancer. Cancer Res， 1998，58（6）：1130-4.

[20]Giles RH， van Es JH， Clevers H. Caught up in a Wnt storm： Wnt signaling in cancer. Biochim Biophys Acta， 2003，1653（1）：1-24.

[21]Nguyen DX， Chiang AC， Zhang XH， et al.WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 2009，138：51-62.

[22]Taniguchi K， Roberts LR， Aderca IN， et al.. Mutational spectrum of beta-catenin， AXIN1， and AXIN2 in hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Oncogene. 2002，21：4863-4871.

[23]Satoh， S.; Daigo， Y.; Furukawa， et al. AXIN1 mutations in hepatocellular carcinomas， and growth suppression in cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1. Nat. Genet. 2000，24：245-250.

[24]Bittner M， Meltzer P， Chen Y， et al. Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature，2000，406（6795）：536-40.

[25]Morgan RA， Dudley ME， Wunderlich JR， et al. Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes. Science， 2006，314（5796）：126-129.