BioID技術在腫瘤蛋白質組學中的發展與應用

王曉飛 丁明

摘? 要：蛋白質通過形成復合物或蛋白-蛋白相互作用來執行生物學功能，蛋白-蛋白相互作用是細胞生命活動的基礎，也是整個生物學領域研究的核心問題之一。傳統的互作蛋白篩選方法包括酵母雙雜交和串聯親和純化等，但這些方法具有一定的局限性，很難適用于實時和動態蛋白相互作用分析。鄰近依賴生物素鑒定（BioID，proximity-dependent biotin identification）是篩選活細胞中發生的蛋白相互作用的獨特方法，利用修飾過的生物素連接酶BirA與感興趣的蛋白融合表達，生物素化近端內源蛋白質，生物素化的蛋白可以被選擇性分離并用生物質譜鑒定出目標蛋白的候選相互作用物。BioID已成功應用于不溶性蛋白及瞬時或弱相互作用蛋白的研究，也逐漸應用于腫瘤等疾病發生機制及藥物靶點篩選的研究。文章針對該技術進行了詳細總結，并討論了其在腫瘤蛋白質組學中的應用。

關鍵詞：BioID;鄰近蛋白標記;蛋白-蛋白相互作用

Abstract： Proteins perform biological functions by forming complexes or protein-protein interactions. Protein-protein interaction is not only the basis of cell life activities， but also one of the core issues in the whole biological field. Traditional protein screening methods include yeast two-hybrid and tandem affinity purification， but these methods have some limitations and are difficult to be applied to real-time and dynamic protein interaction analysis. Proximity-dependent biotin identification （BioID） is a unique method for screening protein interactions in living cells. Using the fusion expression of modified biotin ligase BirA with proteins of interest， biotinylated proximal endogenous proteins and biotinylated proteins can be selectively isolated and candidate interactions of target proteins can be identified by mass spectrometry. BioID has been successfully applied to the study of insoluble proteins and transient or weakly interacting proteins， and also gradually applied to the pathogenesis of tumors and other diseases as well as drug target screening. In this paper， this technique is summarized in detail， and its application in tumor proteomics is discussed.

前言

在生命體中，蛋白質是發揮作用的主體。細胞中各種復雜的生理活動以及細胞對外部環境的反應均基于蛋白質之間的相互作用，從而形成復雜的信號轉導網絡。蛋白質相互作用（PPI）包括形成比較穩定的蛋白質復合物或瞬時相互作用，一些蛋白質之間的瞬時相互作用往往具有重要的生理功能。PPI大多是一種動態的過程，會隨著時間、細胞周期進程或組織類型而改變，并且可能受到如翻譯后修飾，蛋白質的構象變化等許多因素的影響，具有瞬時性、弱相互作用和受多因素調節等特點[1]。目前已開發了許多方法以研究PPI，例如酵母雙雜交和串聯親和純化等[2，3]。對于穩定的PPI，依賴于親和純化的生物化學方法可靠并被廣泛使用，串聯親和純化使用兩個標簽經過兩步連續的親和純化，提高了純化產物的特異性，但缺點是有些瞬時性及弱相互作用難以檢測到[3]。基于PPI親和力，還開發了一些高通量篩選方法，最廣泛使用的酵母雙雜交系統可用于鑒定給定靶蛋白的候選相互作用配體。這種基于酵母的方法也已經升級以適應哺乳動物細胞中的應用，然而酵母雙雜交系統也存在著高假陽性率和陰性結果[2]。

通過修飾酶進行鄰近標記是一種新的PPI篩選方法，可以實現對瞬時和弱相互作用的檢測。將修飾酶與感興趣的蛋白質進行融合，修飾酶就能對目的蛋白附近及潛在相互作用的蛋白質進行標記。此類技術的實例包括使用辣根過氧化物酶（HRP，horseradish peroxidase），抗壞血酸過氧化物酶（APEX，engineered ascorbate peroxidase）和鄰近依賴生物素標記（BioID）的選擇性蛋白質組鄰近標記[4]。BioID技術相比傳統的蛋白相互作用發現方法具有顯著優勢，適用于鑒定瞬時性、弱相互作用、不溶性細胞結構以及機體內動態過程。本文主要對BioID鄰近依賴生物素鑒定進行總結歸納，闡述了其原理和方法及其在腫瘤疾病中蛋白相互作用鑒定的應用。

1 BioID技術的策略

1.1 生物素連接酶（BirA）

2001年，Parrott等人[5]提出BirA可用于生物素化蛋白質，并將其應用在分泌蛋白或膜結合蛋白上。BirA屬于生物素連接酶的一種，來源于大腸桿菌，大小約為35.5 kDa，包含三個結構域：N-末端DNA結合結構域，中心催化結構域和C-末端結構域，其中心催化結構域負責結合ATP并與靶蛋白相互作用[6]。de Boer等人[7]首次成功應用了基于BirA的體內生物素化，利用BirA檢測到了能與目標蛋白GATA-1（紅系特異核蛋白轉錄因子）相互作用的分子，從而找到其潛在的分子靶點。2004年，Choi-Rhee等人[8]對生物素連接酶BirA進行突變研究，通過篩選得到一種BirA的突變體BirA*（R118G）。2012年，Roux 等人[6]將這種利用BirA的突變體BirA*（R118G）在細胞內標記相互作用蛋白的方法稱為BioID。該一系列的工作奠定了將BirA蛋白用于鄰近相互作用堅定的工作基礎。

1.2 BioID的技術原理

BioID通過生物素連接酶BirA來篩選生理相關的蛋白質，野生型BirA僅能標記一個蛋白，BioID利用大腸桿菌BirA*（R118G）的突變形式，促進近端蛋白的生物素化[6]。野生型BirA生物素化是一個兩步反應，先是BirA催化生物素和ATP生成活化的biotinoyl-5'-AMP中間體，并將其保持在自身的活性位點上，即中心催化結構域上;隨后與靶蛋白上的特定賴氨酸反應，在生物素和賴氨酸側鏈之間形成酰胺鍵，形成生物素化的靶蛋白，釋放出AMP。BirA需要特異性識別一段15個氨基酸的序列來生物素化目的蛋白，這樣的要求大大減少了潛在的目標蛋白質的數量。相反，BirA的突變形式BirA*，在活性位點攜帶R118G突變，且活性比BirA高，對biotinoyl-5'-AMP的親和力顯著降低并提前釋放，從而導致活化的biotinoyl-5'-AMP脫離催化中心，非特異性地與鄰近蛋白質上的伯胺進行共價結合，即突變的BirA*不需要識別特定的氨基酸也能使其周圍的分子生物素化[9，10]。但BirA*的標記半徑僅為10nm左右，在目的蛋白附近10nm范圍內的蛋白都會被生物素化而被鑒定出來。因此只能對鄰近蛋白質實現非特異性的標記，需要謹慎解釋陰性結果，因為在分析中可能遺漏了一些已知的相互作用伴侶[11]。

在2016年，Kim和Roux等人[12]對BioID進行了改進，提出了BioID2，基于來自超嗜熱菌（A. aeolicus）的BirA（R40G），缺乏DNA結合結構域，分子量更?。?7kDa），有利于準確定位融合蛋白及與靶蛋白結合，且需要加入的生物素少于第一代BioID，生物素化標記效率更高。與 BioID 相比，BioID2的生物素化范圍和效率顯著增強，因此能夠檢測到第一代連接酶難以生物素化的蛋白質[12]。

1.3 BioID的技術流程

BioID分析過程可分為：（1）在哺乳動物（或其它）表達載體中生成和表征BioID 融合蛋白以穩定表達細胞系;（2）使用該細胞系用于大規模 BioID pull down并通過質譜鑒定蛋白質候選物。BioID 技術的操作主要包括以下流程：（1）構建BioID融合蛋白的表達載體，穩定表達融合BirA的目的蛋白;（2）在特定條件下添加生物素誘導，生物素化目的蛋白附近的蛋白;（3）提取總蛋白并將其與鏈霉親和素磁珠結合孵育，富集被生物素化的蛋白;（4）利用Western-blot以及質譜分析的方法，對富集到的生物素化蛋白進行鑒定[13]。

2 BioID在腫瘤蛋白質組學中的應用

BioID技術通過BirA*形成融合蛋白來鑒定蛋白相互作用，而蛋白相互作用在腫瘤等疾病的發生過程中也是時刻存在的，利用BioID技術對腫瘤發生過程中的蛋白進行標記，再結合高分辨質譜技術，就有可能找到相關的靶點蛋白，解釋腫瘤發生的機制。因此，BioID技術逐漸被應用于腫瘤機制的研究及藥物靶點的篩選。

Ras蛋白是Ras基因表達產物，分子量為21kDa，屬于單體GTP結合蛋白，具有GTPase活性。野生型Ras受到機體嚴格的調控，其與GTP結合時為活性狀態，而與GDP結合時為非活性狀態，形成一種動態平衡，但平衡會被Ras的突變所打破。在大約三分之一的人類癌癥中發現了三種主要Ras亞型HRAS、NRAS和KRAS的突變，但由于Ras的結構和復雜的調控機制，靶向治療仍然是一個挑戰[14]。以往的蛋白質組學分析受到實驗工具的限制，無法捕捉Ras在細胞中相互作用的動態過程及瞬態性質。Kovalski等人[15]將BioID技術與CRISPR篩選相結合，鑒定Ras依賴癌細胞生長所需的Ras近端蛋白質。該實驗對野生型Ras蛋白和三種突變型Ras蛋白均進行了BioID實驗，將BirA*與野生型Ras蛋白及三種突變型Ras蛋白融合，通過質譜分析鑒定出了690個Ras近端蛋白，其中150個蛋白在3種Ras突變型中均存在，進而確定了活性Ras和mTOR復合物2（mTORC2）之間的相互作用，活性Ras能刺激mTORC2激酶活性。Ras-mTORC2相互作用激活下游促增殖轉錄程序，促進Ras依賴性腫瘤在體內的生長。

正常B細胞發育所必需的轉錄因子經常在B系急性淋巴細胞白血?。˙-ALL）中發生突變，其中突變頻繁的蛋白質包括轉錄因子PAX5，這些突變通常導致轉錄因子功能的部分喪失。雖然PAX5的功能與人類惡性腫瘤有明顯的關系，但是沒有足夠的證據表明PAX5的雜合子缺失對B細胞祖細胞的發育和功能有顯著影響，因此PAX5可能是B-ALL靶向的轉錄因子網絡的一個組成部分[16]。Okuyama等[17]為了研究與PAX5相關的功能網絡，他們使用BioID技術在活細胞中分離與該轉錄因子相關的蛋白質，將生物素連接酶BirA*與PAX5融合，融合蛋白在小鼠Abelson病毒轉化的Pre-B細胞系中表達，通過質譜鑒定出239種蛋白質，其中幾種蛋白在人類B-ALL中發生了突變，包括IKZF1和RUNX1，通過BioID與ChIP-Seq兩種方法的應用證明了PAX5是淋巴白血病靶向功能性轉錄因子網絡的一部分，經常被B-ALL中的多個突變所靶向，從而揭示白血病細胞中的分子相互作用。

作為去泛素酶，泛素羧基端水解酶UCH-L1屬于UCH亞家族，主要在腦組織中表達，在其他組織中的表達水平較低，但在一些癌癥中發現了UCH-L1的過度表達，比如骨髓瘤、前列腺癌及神經母細胞瘤等[18]。然而，UCH-L1在乳腺癌侵襲中的作用尚不清楚。Luo Y等人[19]研究發現UCH-L1在具有更高侵入能力的癌細胞中表達水平顯著增高。雖然異位UCH-L1表達未能改變MCF-7（人乳腺癌）細胞中的細胞增殖，但它引起細胞侵襲的能力顯著上調。此外，siRNA介導的UCH-L1敲低導致UCH-L1過表達MCF-7細胞的侵襲抑制。為了研究這些觀察結果的分子機制，Luo Y等人通過BioID技術將BirA*與UCH-L1蛋白的N-末端融合，形成融合蛋白BirA*-UCH-L1，然后，我們在MCF-7細胞中表達了BirA*-UCH-L1，通過質譜鑒定顯示UCH-L1可以與MCF-7細胞中的Akt相互作用。用His標記的重組UCH-L1蛋白和MCF-7細胞裂解液進行pull down實驗進一步證明UCH-L1優先結合Akt2用于Akt的活化。該實驗證明UCH-L1的過表達導致Akt的激活，也表明UCH-L1能促進乳腺癌細胞的侵襲，因此可以作為治療乳腺癌的潛在治療靶標。

肺癌是導致全球癌癥死亡的主要因素之一，鱗狀細胞癌（SQCC）是肺癌中比較常見，屬于非小細胞肺癌的一種。SQCC被認為起源于支氣管基底細胞，通過吸煙引起的損傷反應導致該干細胞群體發生增生性鱗狀病變。經實驗統計證明，在94%的SQCC中3q26-28區域中SOX2的拷貝數增加，并通過穩定干細胞的初始鱗狀損傷反應和促進浸潤性癌的生長在疾病進展的早期和晚期起作用[20]。因此抗SOX2靶向策略可以幫助治療鱗狀細胞癌，Kim等人[21]使用BioID技術表征體內SOX2的相互作用組，以期找出能夠間接干擾SOX2活性的新策略。該方案確定了82個高豐度的SOX2互動蛋白，隨后在基底細胞和SQCC中都驗證了SOX2與共激活因子EP300的相互作用，證明了EP300對于基底細胞中的SOX2活性是必需的，EP300拷貝數在SQCC中也是增加的，因此EP300可以作為治療鱗狀細胞癌的潛在治療靶標。

3 結束語

自BioID技術問世以來，其在PPI的鑒定中廣泛應用，也為腫瘤等疾病機制的研究和藥物靶點的發現提供了一種新的方法。BioID的優勢在于它能夠識別與目標蛋白質間接或弱相互作用的蛋白質，實現蛋白質相互作用中動態過程及瞬時相互作用的鑒定。重要的是，這種方法的應用非常簡單，輸出信息豐富。但BioID技術也存在一些不足：（1）在BirA*的標記范圍內，位于目的蛋白附近的蛋白質都會被生物素化而被鑒定出來，這是一種非特異性的標記，可能會產生陰性結果，某些候選蛋白與目的蛋白之間并不存在相互作用;（2）通過BioID和質譜方法鑒定出的候選蛋白的豐度不能代表候選蛋白與目的蛋白生物相關性的強弱;（3）BirA*本身具有一定的尺寸大小，可能會影響一些分子質量較少的目的蛋白的功能及定位。2017年Munter等人[22]提出了Split-BioID，該方法將BirA*分成兩個片段，N端的BirA*和C端的BirA*，它們單獨存在時并不能發揮功能，但將N-BirA*和C-BirA*分別與兩個目的蛋白融合，當這兩個融合蛋白質因為相互作用而靠近時，N-BirA*和C-BirA*才能形成有功能的完整的BirA*，從而可以特異性地標記目的蛋白復合物的相互作用蛋白。該方法將蛋白質片段互補技術與BirA*鄰近標記技術結合，有效解決了BioID非特異性標記的問題。2018年Stewart等人[23]開發了一種新型的雙組分BioID技術（2C-BioID）用于鑒定蛋白質的相互作用，先將生物素蛋白連接酶與目標蛋白分開表達，然后通過添加誘導二聚化試劑誘導二聚化形成BirA*與目標蛋白的復合體，達到標記鄰近相互作用蛋白的目的。在該方法中，將未誘導聚合樣品同樣進行蛋白質組學分析，作為整個方案的對照組，來消除假陽性率，提高BirA*標記的特異性。隨著BioID技術不斷的改進與優化，BioID技術將廣泛應用于蛋白質相互作用的鑒定、腫瘤機制的研究及藥物靶點的篩選中。

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