乳腺癌腫瘤微環(huán)境中HMGB1表達(dá)與MDSC的相關(guān)性

倪 萍，劉月琴，李 旺，蘇兆亮，周成林*

（1.泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300； 2.江蘇大學(xué)免疫學(xué)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

乳腺癌是威脅女性身心健康的一種常見惡性腫瘤，目前關(guān)于乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及病因尚未明確闡述。HMGB1是一種高度保守的核蛋白，其參與了腫瘤細(xì)胞的生殖、分化過程；而MDSC具有顯著的抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的能力[1]。研究表明，乳腺癌患者中HMGB1表達(dá)情況與MDSC具有一定關(guān)聯(lián)性，但目前相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少[2]。鑒于此，本研究主要分析乳腺癌中HMGB1表達(dá)與MDSC的相關(guān)性，旨在指導(dǎo)臨床預(yù)測(cè)乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光定量P C R 試劑盒（大連寶生）；H M G B 1抗體（Abcam）、GAPDH抗體（南京凱基）；PCR引物（廣州復(fù)能）；PE-anti-CD11b抗體、FITC-anti-Gr-1抗體（BD）。 BALB/C裸鼠，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)得。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系來自本研究室。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤鼠模型的建立

BALB/C裸鼠肩胛區(qū)皮下注射MCF-7 106-107細(xì)胞0.3 mL，2周后取腫瘤組織、脾臟和外周血。

1.2.2 流式細(xì)胞儀

將1×106細(xì)胞加入25 μLPBS中，分別加FITC標(biāo)記的Gr-1抗體1 μL和PE標(biāo)記的CD11b抗體2.5 μL，冰上孵育30 min，然后加入1 mL PBS，離心，重復(fù)2次。最后加200 μL PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 Western blot

10 g/L PMSF的裂解液制備總蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉；HMGB1抗體（1：1000）4°C孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1：5000）孵育2 h，ECL法顯色，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)來檢測(cè)蛋白條帶。

1.2.4 RT-qPCR

提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-qPCR檢測(cè)HMGB1表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參照。25 μL體系，擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性15秒，95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸15秒，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Graphpad Prism5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組比較采用Student’s t檢驗(yàn)，Pearson分析相關(guān)性，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MDSC的檢測(cè)

荷瘤鼠脾臟和外周血中MDSC的比例高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（***為p＜0.001）,見圖1。

2.2 癌組織中HMGB1水平

HMGB1蛋白水平（圖2A）、mRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B，P＜0.05）在癌組織中高表達(dá)。

2.3 癌組織中HMGB1和MDSC的相關(guān)性

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)HMGB1和MDSC之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,見圖3。

3 討 論

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，其可通過損傷、壞死的細(xì)胞釋放至胞外，或者通過活化后的細(xì)胞釋放至胞外。已有文獻(xiàn)報(bào)道HMGB1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)；因此有望成為腫瘤治療的新方向。MDSC是一種異質(zhì)性細(xì)胞群體，其在感染、免疫抑制等病理中會(huì)阻礙MDSC分化成成熟細(xì)胞，致使其大量聚集在脾臟、外周血、病變部位等[3]，進(jìn)而抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。細(xì)胞核外的HMGB1促進(jìn)趨化因子釋放，還可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎性因子，導(dǎo)致MDSC積聚，進(jìn)而加重機(jī)體免疫抑制反應(yīng)，由此推測(cè)，HMGB1可能是調(diào)控MDSC的一個(gè)促炎因子[4]。此外，HMGB1可與MDSC表面上的RAGE受體與TLR-4受體結(jié)合，并通過NF-kB、P38MAPK、ERK1/2信號(hào)通路來調(diào)控MDSC分化，致使MDSC積聚，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的抑制作用，加重機(jī)體免疫應(yīng)答抑制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，荷瘤鼠癌組織中HMGB1表達(dá)高于癌旁組織，荷瘤鼠脾臟和外周血中MDSC的比例也高于正常對(duì)照組，且HMGB1高表達(dá)與MDSC比例增加之間呈正相關(guān)。因此，我們推測(cè)可能是HMGB1調(diào)控MDSC的作用參與乳腺癌發(fā)生，但是乳腺癌中HMGB1是如何具體調(diào)控MDSC的以及具體的分子機(jī)制仍待證實(shí)。

綜上所述，HMGB1在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)且與MDSC的關(guān)系呈正相關(guān)，但是在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中HMGB1是如何調(diào)控MDSC分化的仍需研究。為以后乳腺癌的治療提供新的作用靶點(diǎn)。