菊花總黃酮對去勢所致干眼雄兔淚腺組織中AR、AR mRNA、Bax mRNA及形態學的影響

陳立浩　時健　劉倩宏　姚小磊　蔣鵬飛

〔摘要〕 目的 考察菊花總黃酮治療去勢雄兔干眼的具體機制。方法 采取隨機數字法將150只雄兔分為15組，編號分別為A1、A3、A5、B1、B3、B5、C1、C3、C5、D1、D3、D5、E1、E3、E5，每組10只，A-E組中序號對應干預時間，其中A組不做任何干預處理，B組行假去勢術，C、D、E組行雙側去勢術建立雄激素水平缺乏型干眼模型。A、B、C組均用生理鹽水灌胃，D組行雄激素（丙酸睪酮）肌肉注射，E組用菊花總黃酮灌胃。分別于治療后的1、3、5月，將動物處死。觀察：（1）雄激素樣效應 以免疫組織化學法測定淚腺組織中雄激素受體（androgen receptor，AR）光密度，輔以RT-PCR技術測定AR mRNA表達，以觀察淚腺組織中AR上調情況;（2）細胞凋亡 以RT-PCR技術測定淚腺中細胞凋亡相關基因蛋白Bax mRNA的表達;（3）形態學改變 使用透射電鏡觀察淚腺超微結構變化。結果 （1）雄激素樣效應：E組與C組相比，其淚腺組織中AR明顯上調（P<0.01），AR mRNA表達率明顯增長（P<0.01）;（2）細胞凋亡：E組Bax mRNA表達率與C組比較下降明顯（P<0.01）;（3）形態學改變：E組在干預后，線粒體腫脹減輕，丟失或成空泡變，而C組線粒體腫脹，局灶凋亡壞死，凋亡明顯。結論 菊花總黃酮具有較好的雄激素樣效應，能夠抑制Bax mRNA凋亡，恢復淚腺組織形態。它將有望應用于由雄激素水平下降所致干眼的臨床治療中。

〔關鍵詞〕 干眼;去勢雄兔;菊花總黃酮;雄激素樣效應;Bax mRNA;形態學

〔中圖分類號〕R285.5;R777.2+1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.005

Effects of Total Flavonoids from Chrysanthemum on AR， AR mRNA， Bax mRNA and Morphology in Lacrimal Gland of Castrated Dry Eye Male Rabbits

CHEN Lihao1，2， SHI Jian1， LIU Qianhong1， YAO Xiaolei3*， JIANG Pengfei1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the specific mechanism of total flavonoids from chrysanthemum in the treatment of castrated male rabbit dry eyes. Methods A total of 150 male rabbits were randomly divided into 15 groups with random number method， and numbered A1， A3， A5， B1， B3， B5， C1， C3， C5， D1， D3， D5， E1， E3， E5， with 10 rabbits in each group. There was no intervention in group A. Sham castration was given in group B. Bilateral castration was performed in groups C， D and E. Group A， B and C were given normal saline. Group D was given testosterone propionate intramuscular injection， and group E was given total flavonoids of chrysanthemum by gavage. The animals were killed 1， 3 and 5 months after treatment. （1） For the observation of androgen like effect，androgenreceptor（AR） density in lacrimal gland was measured by immunohistochemistry， and AR mRNA expression was measured by RT-PCR to observe the up-regulation of AR in lacrimal gland. （2） For the observation of apoptosis， Bax mRNA expression in lacrimal gland was measured by RT-PCR. （3） For the observation of morphological changes， ultrastructural structural changes of lacrimal gland were observed by transmission electron microscopy. Results （1） androgen like effect： compared with the model group C， the AR in lacrimal gland of group E was significantly up-regulated （P<0.01）， and the AR mRNA expression rate was significantly increased （P<0.01）. （2） Apoptosis： the Bax mRNA expression rate of group E was significantly decreased （P<0.01） compared with that of group C. （3） Morphological changes： after the intervention， the swelling of mitochondria in Group E was reduced， and the mitochondria in group C were lost or vacuolized， whilethe swelling of mitochondria， focal apoptosis and necrosis in group C was obvious. Conclusion The total flavone from chrysanthemum has a better androgen like effect， which can inhibit Bax mRNA apoptosis and restore lacrimal gland morphology. It is expected to be used in the clinical treatment of dry eye caused by the decrease of androgen level.

〔Keywords〕 dry eye disease; castrated male rabbit; total flavones from chrysanthemum; androgen-like effect; Bax mRNA;morphology

干眼是一種以眼睛干澀感為主要癥狀的眼科疾病。本病發病率很高，占眼科門診量的30%以上[1]，這引起社會的廣泛關注。現代研究認為，老年尤其是女性可因機體內部雄激素水平下降而導致干眼[2-3]。部分中藥可替代激素治療干眼，且副作用較后者低，在干眼治療領域前景廣闊。相關研究已經證實密蒙花提取物具備擬雄激素效應，可治療因激素水平下降誘發的干眼。例如密蒙花總黃酮[4-7]及在此研究基礎上密蒙花提取物滴眼液[8-14]、密蒙花顆粒劑[15-17]等相關研究均為此提供了相關證據。為擴大替代激素的中藥提取物的可選擇性，開發新的干眼臨床藥物，基于菊花可清肝明目的中醫學認知，本課題組對杭白菊的提取物——菊花總黃酮進行研究。本次實驗旨在從雄激素受體（androgen receptor，AR）、Bax mRNA、淚腺組織形態學3個方面，進一步探究菊花總黃酮治療雄激素水平下降所致干眼的機制。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗對象? 實驗動物選取2月齡健康雄兔150只（品種為日本大耳白兔，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號：2012-0361，SPF級，遠交系），體質量：2～2.5 kg。

1.1.2? 實驗藥物? 杭白菊總黃酮（生產批號：JH130804，產自蘇州工業技術研究院，用80%濃度的乙醇溶液提取，并經大孔樹脂純化制得，總黃酮質量分數為8.55%），配成濃度為1.80 mg/mL。

1.1.3? 試劑與耗材? 蘆丁試劑（成都曼斯特生物科技有限公司），Trizol（日本TAKARA公司），免疫組織化學試劑盒、顯色劑、RNA酶抑制劑RNasin（來源于大腸桿菌表達的鼠源基因）、多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司），氯仿、異丙醇（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.1.4? 主要實驗設備? Shandon 325 型石蠟切片機（英國Shandon公司），Motic B5顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團公司），TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），EYELA SB-1100旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），DNP-9162型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），DLSB-5/20低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司），iQ5 Real-Time PCR Detection System （美國Bio-Rad公司），日立H-600透射式電子顯微鏡（上海百賀儀器科技有限公司）。

1.1.5? AR引物? 從NCBI中檢索基因序列信息（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank; provided in the public domain by the National Center for Biotechnology Information， Bethesda， MD），并利用primer5軟件設計引物。引物來源于日本Takara公司。正向鏈：5′-TCCACCTCCTCCAAGGACAGT-3′，反向鏈：5′-CCAA？鄄CGCCTCCACACCCAA-3′;β-actin：正向鏈：5′-TCCTTCCTGGGCATGGAGTC-3′，反向鏈：5′-GGATGTCCACGTCGCACTTC-3′;Bax引物：正向鏈：5′-CGAGTGTCTCCGGCGAATTG-3′，反向鏈：5′-ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3′。擴增引物長度分別為56 bp、152 bp、48 bp。

1.2? 方法

1.2.1? 動物及分組? 取健康2月齡雄性日本大耳白兔150只，采取隨機數字法將其分為A1、A3、A5、B1、B3、B5、C1、C3、C5、D1、D3、D5、E1、E3、E5共15組，每組10只。A、B、C、D、E分別代表正常組、假手術組、模型組、雄激素對照治療組和菊花總黃酮治療組，1、3、5分別代表干預1、3、5個月。

1.2.2? 干眼模型的建立? 采用去勢方法對雄性日本大耳白兔進行造模[15]。A組為空白組，不做特殊處理;B組行假去勢術作為對照，只切開陰囊，不切除睪丸;C、D、E組行雙側睪丸切除術（ORX），切除雄兔的雙側睪丸及附睪。去勢后飼養1月、3月、5月分別表示建立輕度、中度、重度干眼模型。

1.2.3? 干預方法? 造模手術后1周開始干預。A、B、C組以生理鹽水按5 000 mg/kg灌胃，每日1次;D組以1∶4麻油稀釋后的雄激素（丙酸睪酮注射液）按500 mg/kg大腿肌肉注射，每3日1次;E組以1%菊花總黃酮混懸液（杭白菊總黃酮63.6 mg溶解于生理鹽水10 mL）按5 g/kg灌胃，每日1次。A-E組中序號對應相應的干預時間，1、3、5組分別灌胃1、3、5個月。實驗過程中，使用常規飼料喂養雄兔。

1.2.4? 取材? 處死動物（采用靜脈空氣注射法），并即刻摘除淚腺。將淚腺剪為3份：一份4%多聚甲醛保存、常規石蠟包埋，并利用石蠟切片機連續切片，適用于免疫組織化學方法檢測;一份低溫保存，用于RT-PCR檢測;一份戊二醛保存，供電鏡觀察用。

1.2.5? 檢測指標? （1）免疫組織化學法測定雄兔淚腺組織中雄激素受體（androgen receptor，AR）光密度。將淚腺組織的石蠟切片脫臘至水，使用蒸餾水洗滌（2 min×2次）。按照武漢博士德生物工程有限公司生產的免疫組化染色劑試劑盒說明書進行操作。染色成功后，使用免疫組化測量軟件系統進行測量及半定量分析：隨機統計各組5～7個高倍視野中AR數值，以該值除以組數，結果即為AR的平均光密度值。系統參數：像素點長2.105 μm，窗口面積1.271×106 μm2。（2）RT-PCR法測定AR mRNA、Bax mRNA的表達。檢測AR mRNA：取冷凍組織100 mg提取總RNA，濃度調為1 μg/μL;將2 μg總RNA在20 μL反應體系中逆轉錄成cDNA;取其于40 μL反應體積（10×Buffer 4 μL、dNTP 0.8 μL、MgCl2 3.2 μL、5 U/μL TaqDNA多聚酶 0.3 μL、模板4 μL、上下游引物各0.3 μL、去離子水27.1 μL）中進行PCR反應，熱循環運行參數為AR：93 ℃ 3 min，進入循環，93 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s;29個循環，72 ℃ 10 min。β-actin：94 ℃ 3 min，進入循環，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s;29個循環后，72 ℃ 5 min;擴增后顯影、攝影，以AR mRNA光密度值與β-actin mRNA光密度值的相對比值為AR mRNA的相對表達量。Bax mRNA的檢測及分析方法同上。（3）透射電鏡檢測淚腺組織形態學的變化。將淚腺組織從戊二醛固定液中取出后，以PBS漂洗3次，再以1%鋨酸后固定，透射電鏡觀察淚腺超微結構變化。

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〔收稿日期〕2019-12-30

〔基金項目〕國家自然科學基金地區基金項目（81260550）;國家中醫藥管理局中醫眼科學重點學科建設項目（ZK1801YK015）;中醫藥防治五官科疾病湖南省重點實驗室建設項目（2017TP1018）;湖南省中醫五官科學重點學科建設項目;湖南中醫藥大學中醫學國內一流建設學科項目。

〔作者簡介〕陳立浩，男，在讀碩士研究生，研究方向：眼表與淚液疾病。

〔通訊作者〕*姚小磊，男，主任醫師，副教授，博士研究生導師，E-mail：yxlshh@126.com。