紫錐菊與黃芪多糖對環磷酰胺致免疫功能低下小鼠的影響

劉喜雨 曹榮昌 陳富珍 黃建新

（大理農林職業技術學院 671003）

紫錐菊 (Echinacea)，又稱 “金花菊”，屬于菊科，是一種多年生植物，起源于北美東部，且在北美洲作為藥用植物已有上百年的歷史，最早用于治療感冒及上呼吸道感染［1，2］。近幾年，紫錐菊多糖 （Echinacea purpurea Polysaccharide，EPS）的應用已逐漸從臨床治療向動物生產方向轉移，且大量體內與體外試驗結果顯示，紫錐菊多糖主要通過增強機體免疫力發揮抗炎、抗細菌和抗病毒等方面的功效。而近幾年紫錐菊多糖已作為一種飼料添加劑應用在畜禽生產中[3]。

黃芪多糖 （Astragalus polysaccharin，APS）是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血糖、抗衰老、增強機體免疫功能等廣泛的生物學功能[4，5]，將其作為飼料添加劑或疫病預防治療藥物能增強動物細胞生理代謝、提高細胞免疫應答水平、抑制或消滅病原微生物的繁殖、提高動物生長性能和免疫功能[6]。

紫錐菊與黃芪多糖提取物均具有抗菌、抗病毒、增強細胞免疫和體液免疫的作用。目前對于二者應用的研究很多，但就其不同劑量組合應用對小鼠免疫功能的影響研究較少。本試驗通過將二者按不同劑量組合配伍，探討其對環磷酰胺致小鼠免疫力低下時的影響，為后續研究提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

2018年10月30日申購65只4～6周齡雌性清潔級ICR小鼠，11月8日小鼠到貨，共65只，均重約15g/只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。飼喂適應1周后進行試驗。

1.1.2 藥品與試劑

（1）藥品：紫錐菊顆粒， （規格：1g相當于原生藥1.25g），購自山東齊魯動物保健品公司；黃芪多糖粉 （芪黃素）， （生產批號：1709201，規格：1g相當于原生藥1.25g），購自愛迪森 （北京）生物科技有限公司；環磷酰胺， （批號：13051025；有效期：2019.05.03，規格：0.2g/瓶），購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

（2）試劑：氯化鈉 （10019318）、氯化鉀 （10016318）、磷酸二氫鉀 （XK13～201）、磷酸氫鈉 （10020318）、葡萄糖（10007118），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組及給藥程序

選取60只雌性清潔級ICR小鼠稱重，隨機分成10組，按體重分為 19～20g， 20～21g， 21～22g， 22～23g， 23～24g， 24～25g，25～26g排列，然后按照S型取樣，每組6只，各組小鼠平均體重差異不超過1g。對10組進行標記，空白對照組腹腔注射0.2ml/d PBS緩沖液，其他各組腹腔注射0.2ml 80mg/(kg·d)CTX供試液，連續給藥3d。而后，空白對照組和陽性對照組連續5d灌胃等體積PBS緩沖液，其余8組小鼠連續5d分別灌胃高、中劑量的EPS、APS和EPS+APS不同劑量組合。小鼠分組及處理方式見表1。

1.2.2 供試液的制備

（1）CTX母液的制備

取一個1.5ml離心管 （采用小容量管稱取是為了減少誤差）稱取CTX原粉0.12520g，在無菌室加入PBS緩沖液反復稀釋轉移至10ml離心管中，超聲溶解均勻，用5ml注射器吸取5ml，去掉針頭，套上過濾頭 (以0.22μm過濾器過濾)，將藥液注入50ml管中，同樣方法把剩下5ml也過濾加入50ml管中；再加入PBS緩沖液15ml，定量至25ml.制成5mg/mlCTX藥物母液。如表2所示。

表1 小鼠分組、給藥劑量及處理方式

（2）CTX供試液的制備

取1根50ml離心管按下表先加入藥物母液，再加PBS順序，渦旋混勻，制備供試液28ml。如表3所示。

（3）藥物供試液的制備

先配制好母液，再取10根10ml離心管，做好標記。按下表先統一加入藥物母液，再加PBS順序，渦旋混勻，制備供試液20ml。按照給藥方案灌胃給藥，每天1次，連用5d。如表4所示。

1.3 相關測定

末次灌胃后24h，取股動脈血分離血清，取脾臟制備單細胞懸液進行免疫指標檢測。

1.3.1 血清中細胞因子含量測定

股動脈采血分離小鼠血清，按試劑盒說明書操作，采用ELISA法測定小鼠血清IL-2和TNF-α水平。

1.3.2 小鼠脾淋巴細胞增殖反應

表2 CTX母液的制備

表3 CTX供試液的制備

斷頸處死小鼠，無菌條件下取小鼠的脾臟，加適量Hank's液研磨，綢布濾過，1500r/min離心5min，棄上清。渦旋細胞沉淀，加Hank's液重復洗滌2次。收集脾細胞，加適量RPMI 1640完全培養液混懸，以臺盼藍拒染法計數，活細胞數不少于95%，加RPMI 1640完全培養液稀釋，并調整至所需的細胞濃度 （實際為細胞懸液倍比稀釋，酶標儀測OD值，制備細胞數～OD值標曲進行計數）。于96孔微量板中，每孔加脾細胞懸液（7.5×106個/ml） 100μL， 每個脾細胞樣品重復 12孔， 分別加Con A液 （終濃度為 5μg/ml）、 LPS液 （終濃度為 10μg/ml） 或RPMI 1640培養液至總體積為200μL，重復3孔。另設培養液空白對照組。37℃、5%CO2培養44h，各孔加MTT溶液 （2mg/ml）50μL，繼續培養4h。1800r/min離心 5min，棄去各孔上清，分別加DMSO溶液150μL，于室溫暗處以微量振蕩儀振蕩15min，以酶標儀于波長490nm處測定OD值，計算刺激指數（SI值）。

刺激指數 (Stimulatory index，SI)=加有絲分裂原培養物的OD值不加有絲分裂原培養物的OD值

1.3.3 NK細胞活性測定

取指數生長期的人紅白血病K562細胞或小鼠淋巴瘤YAC-1細胞，加入RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度為3×105cell/ml，作為靶細胞；取制備的1×107cell/ml的脾細胞懸液作為效應細胞。于96孔細胞培養板上，每孔加入效應細胞懸液100μL(1×106cell)，重復8孔。其中4個復孔每孔加入靶細胞懸液 100μL(3×104cell)作為實驗孔 （效靶比 50：1）， 另外 4個復孔每孔加入RPMI-1640完全培養液100μL作為效應細胞對照。再設靶細胞對照組 （每孔加入靶細胞懸液100μL和RPIM-1640完全培養液100μL）和空白對照組 （即每孔加入RPIM 1640完全培養液200μL）。置于37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育 1h。每孔加入 MTT溶液 （2mg/ml）50μL，繼續孵育 4h。1500rpm離心5min，棄去上清液，加入DMSO 150μL/well，于室溫暗處以微量振蕩儀振蕩15min，以酶標儀于波長490nm處測定OD值，并計算NK細胞活性。

1.3.4 脾細胞上清中細胞因子含量測定 （ELISA）

于24孔細胞培養板中，取制備的脾細胞懸液，每孔加7.5×106cell/ml的脾細胞懸液1ml和刺激原稀釋液 (ConA終濃度為4μg/ml)各1ml，置于37℃、5%CO2細胞培養箱內培養72h，2500rpm離心5min，收集細胞上清。根據小鼠細胞因子 （INF-γ、IL-10）ELISA檢測試劑盒說明書，測定細胞因子含量。

1.3.5 血清免疫球蛋白測定

按試劑盒提供的ELISA法測定血清IgG、IgM和IgA水平，向酶標板內加入陰性對照、標準品或經稀釋的待測血清樣品100μL，做復孔。酶標板加上覆膜，水平放置，室溫孵育60min。棄去液體，甩干，用洗滌液洗滌4次，甩干。每孔加酶標抗體100μL，加上覆膜，室溫避光孵育30min。棄去液體，甩干，用洗滌液洗滌4次，甩干。每孔加TMB底物溶液100μL，室溫避光孵育10min。依序每孔加終止溶液100μL，終止反應。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的光密度值 (OD值)。

表5 小鼠平均體重指數

2 結果

2.1 體重指數

CTX造模3d后造模小鼠均出現體重明顯下降，造模成功；連續5d灌胃不同劑量組合藥液后得到，體重快速恢復增加的前3組分別是CTX陽性對照組、PBS空白組和EPS（中劑量1.25）與APS（高劑量3.75）組；體重恢復慢的后3組分別是EPS（高劑量2.5）與APS（高劑量3.75）組、EPS（中劑量1.75）組、APS（中劑量1.875）組。說明紫錐菊多糖與黃芪多糖不同劑量組合并沒有明顯增強小鼠的免疫調節機制。每組平均體重指數變化如表5所示。

2.2 脾臟指數

通過對脾臟進行脾細胞增殖的相關試驗，得出脾臟指數如表6所示。

表6 每組小鼠脾臟指數統計

2.3 IgG、IgM含量測定結果

由圖1、2可知，通過收集小鼠血清檢測，模型組小鼠血清IgG、IgM抗體水平明顯低于空白對照組，造模成功，但給藥后效果不顯著。

3 討論

免疫增強劑是一類通過非特異途徑提高機體對抗原的特異性反應的物質。有利于增強機體的免疫功能，緩解環境應激造成的免疫功能紊亂或下降，使人或動物健康生長。紫錐菊和黃芪現已成為國內外普遍應用的免疫增強類天然藥物之一，普遍應用于臨床治療增強人或動物的免疫機能。

許多研究表明，紫錐菊富含揮發油、有機酸、多糖等多種活性成分，具有改善機體免疫功能，降低動物的發病率，從而提高動物的生長性能[6]。姚維平等[7]報道在斷奶仔豬日糧中添加0.5%、1.0%、1.5%的紫錐菊復方可以顯著改善斷奶仔豬生長性能一致。梁華平等 （1994）[8]測定發現，燒傷后6d小鼠的脾臟指數和胸腺指數降低，腹腔注射250mg/kg體重黃芪多糖，每天1次，連續5d，不僅可以明顯提高正常小鼠的脾臟指數和胸腺指數，還可使燒傷小鼠的脾臟指數和胸腺指數恢復正常。倪耀娣等[9]發現，紫錐可提高肉雞對IBD疫苗的免疫力，并能顯著改善和提高肉雞的生產性能。其中最佳添加劑量為0.5%紫錐菊提取物單劑。在和黃芪配伍后，合劑 (0.5%+0.25%)、合劑 (1%+0.5%)劑量的免疫促進效果與0.5%紫錐菊提取物單劑一致。所以本次試驗導致小鼠體重恢復較慢的原因可能是藥物配伍劑量不足。

黃芪多糖能明顯增加小鼠脾臟、胸腺重量，同時能對抗免疫抑制劑潑尼松龍或強的松龍所造成的對脾、胸腺、腸淋巴結等免疫器官的萎縮作用，也能對抗環磷酰胺引起的脾臟萎縮。毛曉峰等[10]發現，黃芪多糖能提高免疫應激后斷奶仔豬的細胞免疫功能，降低炎性因子和應激激素的分泌，從而發揮抗免疫應激作用。張艷等[11]研究結果提示，APS對燒傷小鼠的免疫調節作用依賴于巨噬細胞，通過調節其分泌白細胞介素-1（IL-1），抑制前列腺素E2（PGE）合成，而促進IL-2產生及IL-2受體 （IL-2R）2表達，進而增強T淋巴細胞增殖。邱培勇等[12]研究發現，環磷酰胺對小鼠免疫功能有明顯抑制作用，黃芪多糖不僅能有效抑制抗免疫，對正常小鼠也有免疫增強作用。顏培宇等[13]發現，APS能重建免疫功能低下小鼠機體正常的免疫功能，促進機體ThO向Thl的分化，維持Thl的優勢狀態，增強機體細胞免疫功能。王曉珊[14]報道了在雞飼料中添加1.0%紫黃散能明顯提高雞的生長性能與免疫功能。不同畜禽因生理機能不同，藥物劑量組合不同，通過試驗設計出適合于各種畜禽標準的劑量組合，更好地服務于畜禽生產，是今后研究的一個重點課題。

4 結論

紫錐菊多糖與黃芪多糖均具有抗菌、抗病毒、增強細胞免疫和體液免疫的作用。而本次試驗效果對小鼠生長性能、IgG、IgM與脾細胞增殖都不明顯，可能是因為不同配伍給藥療程太短、劑量組合不理想及操作失誤等原因，沒能明顯體現出紫錐菊多糖與黃芪多糖配伍對免疫抑制小鼠的免疫調節作用。所以本次試驗設計有待進一步完善，希望試驗結果能對研究人員在進行深入研究時有所幫助。