一例豬偽狂犬病毒與大腸桿菌混合感染調查分析

莫云鋒

（廣西岑溪市馬路鎮水產畜牧獸醫站 543202）

豬偽狂犬病毒是皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘-帶狀病毒屬的成員[1]，是危害全球養豬業的最為重要傳染病之一，具有流行廣泛、傳播迅速、發病率與致死率高等特征[2]。早在1813年就有此病的報道，1910年Schmiedhoffer首次分離到該病毒。在我國，1947年劉永純首次分離出PRV，1956年周圣文等人在哺乳豬中發現該病，自1979年確定為豬偽狂犬病以來，世界多個國家都有此病的爆發，給養殖業造成巨大的經濟損失。豬偽狂犬病侵害不同年齡段的豬群，對2周齡內的仔豬危害最為嚴重，可達到100%。主要以高熱、呼吸困難、震顫等癥狀為特征，成年豬以呼吸道癥狀為主，康復后的成年豬通常生長緩慢，嚴重制約我國養豬業的健康發展，造成的經濟損失日趨嚴重[3]。

豬大腸桿菌病是一種革蘭氏陰性短桿菌，是動物體內重要的腸道菌群，屬于條件性致病菌，大多不致病，但某些血清型菌株的致病性較強，可引起腹瀉，稱為致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌是一種重要的人獸共患病原菌，其血清型較多，給防控帶來一定的難度。豬大腸桿菌病是一種急性傳染病，由致病性大腸桿菌引起，主要以腹瀉為主[4]。豬感染大腸桿菌后發生腹瀉，繼而導致機體脫水，敗血癥或繼發其他疫病，給養豬業帶來嚴重影響。

1 材料

1.1 主要試劑和儀器

病毒DNA/RNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DL 2000 DNA Marker均購自北京康為世紀生物科技有限公司；血平板培養基購自北京陸橋技術有限責任公司；微量生化反應管和藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。PCR儀、凝膠成像系統，購自Bio-rad公司。

1.2 樣品來源

2019年10月廣西某豬場育肥豬的脾臟、肺臟、腦、淋巴結等病料樣品。PRV陽性疫苗保存于岑溪市動物疫病預防控制中心實驗室。

2 診斷方法

2.1 臨床癥狀及剖檢變化

病豬出現精神不振，體溫升高，呼吸急促，腹瀉。對病死豬剖檢可見，腹股溝淋巴結水腫，肝臟有白色壞死點，肺臟水腫，脾臟腫大，小腸系膜和胃漿膜有點狀出血，胃底黏膜潰瘍，胃腸黏膜呈現卡他性、出血性炎癥變化。

2.2 細菌學檢查

用接種環取淋巴結、脾臟和肺臟樣品，采用平板劃線法，接種在血瓊脂培養基平板上，置于37℃恒溫培養箱中過夜培養18～24h后觀察，并進行細菌形態學觀察及鑒定。

2.3 藥敏試驗

采用K-B紙片法[5]，選用青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等10類共14種常用抗菌藥物進行體外藥敏試驗。

2.4 病原檢測

2.4.1 病料DNA的提取

無菌剪取病死豬的肺臟、脾臟、淋巴結等病料樣品放入研磨器中混均研磨，加入適量的滅菌生理鹽水，-70℃反復凍融3次，8000r/min離心5min，取上清液，按病毒DNA/RNA提取試劑盒說明進行組織樣品DNA的提取。提取的病毒核酸-20℃保存備用。

2.4.2 引物設計

擴增偽狂犬病毒gD基因中的基因片段，上游引物為PRVF（5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'）和下游引物為PRV-R（5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'）， 擴增長度 217bp。 引物由廣州華大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR檢測方法

PRV的反應體系為：2×Es Taq MasterMix 13μL，DNA模板3μL， 上游引物、 下游引物各 1μL， ddH2O 7μL， 總體系共25μL。瞬時離心混勻，反應程序為95℃ 1 min，55℃30s，72℃1min，35個循環后，72℃再延伸10min，12℃保存。

3 結果

3.1 細菌的鑒定

在血瓊脂培養基平板上，淋巴結和脾臟均分離到細菌。經革蘭氏染色后鏡檢可觀察到革蘭氏陰性桿菌。將單個菌落接種在麥康凱營養瓊脂培養基上，結果細菌均生長出大腸桿菌特有的粉紅色。進行生化試驗發現此病原菌可以發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，MR試驗陽性。VP試驗陰性，動力試驗陽性，吲哚試驗陽性，不利用枸櫞酸鹽，也不產生H2S氣體。經過以上鑒定可以確定該分離菌為大腸桿菌。

3.2 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果可知 （附表），分離的大腸桿菌對頭孢噻肟高度敏感，對阿米卡星、恩諾沙星、環丙沙星等中度敏感，對頭孢拉定、慶大霉素、壯觀霉素、羅紅霉素、多西環素、諾氟沙星、阿莫西林、氨芐西林、克林霉素、林可霉素耐藥。

3.3 PCR結果

通過PCR方法對病料樣品和陽性樣品分別進行檢測。結果病料樣品和陽性樣品的片段大小均在217bp，表明該病料中PRV為陽性 （附圖）。

4 預防及治療

可采取以下措施預防該病的發生：及時隔離并治療發病豬，對病死豬采取無害化處理，防止病毒和細菌大量繁殖擴散，對已經污染的圈舍、飼具和場地進行嚴格消毒。對病豬采用肌肉注射頭孢噻呋、免疫球蛋白、轉移因子等。對保育豬群進行肌注偽狂犬病毒疫苗，對哺乳仔豬用偽狂犬病毒疫苗滴鼻，豬群飼料中添加黃芪多糖、恩諾沙星，在飲水中添加多維。

5 討論

當前，由于母豬大量使用疫苗，導致偽狂犬病發生于育肥豬的現象比較常見，偽狂犬的凈化問題仍然是當前養豬業較為嚴重的問題之一[6]，因此，通過全群檢測加淘汰野毒陽性豬的方法可以快速凈化豬場。我國研究學者也加強了對不同地區豬偽狂犬病流行病學的監測，山東省豬偽狂犬病野毒抗體陽性感染率高達61.74%，福建省龍巖地區豬偽狂犬病野毒抗體的陽性感染率達30.41%，江蘇地區豬偽狂犬病野毒抗體的陽性感染率達36%[7-9]。以上的流行病學調查結果表明，我國不同地區豬群中均存在一定的豬偽狂犬病流行，豬偽狂犬病感染情況比較普遍，不同地區感染率差異也較大，需要加強其控制和凈化措施，制定科學合理的免疫程序，并加強該病綜合防控十分必要。

目前臨床上沒有有效的疫苗來預防大腸桿菌病，采用抗菌藥物防治仍是主要措施[10]。由于大腸桿菌易形成耐藥性，特別是濫用抗菌藥物，導致耐藥菌株不斷增加，在養殖生產中，抗菌藥物常作為飼料添加劑用來預防和促進動物機體的生長，這些都導致了大腸桿菌耐藥菌株的產生。因此，病豬治療前應先對分離病菌進行藥敏試驗，根據試驗結果選擇敏感性抗生素用于治療。同時應加強環境衛生的控制，及時清掃圈舍，保持豬舍衛生、干燥，使用適宜消毒液進行消毒，最好采取全進全出的飼養模式。