抑菌和烹飪處理對南美白對蝦主要過敏原原肌球蛋白免疫活性的影響

王夢夢 ， 王學麗 ， 李婭茹 ， 藍蔚青 ， 丁 婕 ， 盧 瑛 *

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海201306）

南美白對蝦富含蛋白質、礦物質以及維生素A，還包括二十碳五烯酸 （EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等不飽和脂肪酸，能為人體提供優質蛋白質[1，2]。隨著消費量的逐年增加，引起的安全問題也引起人們的注意。蝦蟹等甲殼類水產品會對特定人體引起過敏反應，被聯合國糧農組織和世界衛生組織定義為8類食物過敏原之一[3]。近年來，已研究證明的甲殼類過敏原有原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）、精氨酸激酶 （Arginine Kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈（Myosin Light Chain， MLC）、 肌鈣結合蛋白（Sarcoplasmic Calcium Binding Protein， SCP）等[5]。 其中，原肌球蛋白為主要過敏原，占蝦總蛋白質質量分數6%，相對分子質量在 3.4×104～3.6×104，具有熱穩定性，主要引起IgE型過敏反應[6]。據統計，在亞洲兒童食物過敏患者中，甲殼類過敏率占39%，成人甲殼類過敏占33.8%[4]。

研究發現，蝦類過敏原的主要消減方法包括物理法和生物化學法，物理法有加熱、超高壓、輻照、微波、超聲等[9-11]，生物化學法有酶解[12]和美拉德反應[13]。其中，高壓和輻照具有抑菌、殺菌作用，常用于水產品的保鮮處理過程。殼聚糖和茶多酚是兩種常用的生物保鮮劑，具有抑菌和抗菌作用，能夠起到良好的抑菌保鮮作用[14-15]。酸性電解水具有較好的抑菌、殺菌保鮮作用，是一種新型的保鮮技術，常被用于水產品的保鮮研究中[16-17]。水煮和清蒸是我國家庭常用的水產品烹飪方法，研究發現熱處理能夠降低蝦中的可溶性蛋白含量[18]。

為了調查蝦類主要過敏原原肌球蛋白在抑菌保鮮和烹飪處理過程中的含量和活性變化狀況，作者選取殼聚糖和茶多酚兩種具有抑菌作用的生物保鮮劑處理富集的TM，同時用酸性電解水以及酸性電解水結合水煮、清蒸烹飪方式分別處理南美白對蝦，以探究不同抑菌和烹飪處理方法對原肌球蛋白免疫活性的影響，為今后蝦類主要過敏原的風險溯源提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦購于當地菜市場，-40℃保存備用；PVDF 膜（0.45 μm）：美國 Millipore公司產品；R-250考馬斯亮藍染色液、2×上樣緩沖液（Loading Buffer）、HRP-羊抗鼠 IgG：生工（上海）股份有限公司產品；一抗5G5E：作者所在實驗室自制；非預染Marker和預染Marker：美國Thermo公司產品；DAB顯色液（D0426-50SET）：美國Sigma公司產品；脫脂奶粉：美國BD公司產品；Tris-MOPS-SDS電泳緩沖液、12%預制膠：美國GenScript公司產品。

1.2 儀器與設備

JY-ZY3半干式轉移電泳槽：深化生物技術有限公司產品；Bio-Rad小垂直板電泳槽：美國Bio-Rad公司產品；FW～200型強酸性電解水制備儀：日本AMANO公司產品；eppendorf 5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司產品；Sartorius PB-10 pH計：德國Sartorius公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 抑菌保鮮處理 原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）的提取富集方法根據Lasekan等[18]法略有改動。將南美白對蝦去頭剝殼去蝦線，攪碎后用丙酮溶液（4℃預冷）去油脂，過夜風干成為丙酮粉。將丙酮粉和摩爾濃度0.5 mmol/L DTT的PBST緩沖液按照質量體積比1 g∶5 mL勻漿，4℃過夜抽提。抽提液11 000 r/min 20 min離心后取上清液，進行硫酸銨沉淀，將沉淀用PBS溶解煮沸10 min，離心取上清。將上清液透析并凍干，置于-80℃備用。

將富集TM溶液分別與不同質量分數的殼聚糖溶液（分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%）和茶多酚溶液（分別為 0.1%、0.2%、0.6%、0.8%、1.0%）混合，使TM最終質量濃度為400 μg/mL，室溫反應5min后的溶液作為樣品。以質量濃度400 μg/mL的富集TM樣品作為對照。

1.3.2 酸性電解水抑菌及其結合烹飪處理 酸性電解水（acidic electrolyzed water，AEW）：配制質量分數為0.15%的氯化鈉溶液，并倒入電解水制備儀中電解水15 min，收集酸性電解水，避光存放，測得pH為2.30±0.02。現制現用。

單獨酸性電解水處理：將南美白對蝦蝦仁在酸性電解水中浸泡5、10、15 min，將蝦仁和摩爾濃度為0.5 mmol/L DTT的PBST緩沖液按照質量體積比1 g∶5 mL進行抽提，將抽提液煮沸10 min后冰浴20 min，最后11 000 r/min 20 min離心取上清液即為待測樣品溶液。

單獨水煮、清蒸處理：將南美白對蝦蝦仁水煮或清蒸，并在5、10、15 min時取樣，樣品TM粗提取方法同上。

酸性電解水結合水煮處理：將酸性電解水浸泡15 min的南美白對蝦蝦仁繼續水煮處理，并在5、10、15 min時取樣，樣品TM粗提取方法同上。

酸性電解水結合清蒸處理：將酸性電解水浸泡15 min的南美白對蝦蝦仁繼續清蒸處理，并在5、10、15 min時取樣，樣品TM粗提取方法同上。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）根據 Laemmli等人的方法[19]進行。電泳預制膠質量濃度為12 g/dL，樣品上樣量8 μL。將不同待測樣品溶液與2×上樣緩沖液混合并煮沸后的溶液即為電泳樣品。設置電源電壓進行跑膠，待電泳結束后取出預制膠進行考馬斯亮藍染色液染色，然后脫色液脫色至蛋白質條帶清晰。

1.3.4 蛋白質免疫印跡（Western-blotting） 免疫印跡法（Western-blotting）根據 Song等人的方法[7]進行。轉移膠根據SDS-PAGE法制得，并將非預染Marker改為預染Marker。設置半干式轉膜儀電流180 mA運行20 min，將預制膠上的蛋白轉移至PVDF膜。用質量分數為5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后用PBST洗滌膜3次，每次5 min。PVDF膜用TM 的特異性單抗（McAb）5G5E（質量濃度為 1 μg/mL）孵育 1 h，洗滌。然后用 HRP-羊抗小鼠 IgG（1∶2 500）溶液孵育1 h，洗液洗滌。加入DAB工作液，顯色5 min，用去離子水洗去殘留顯色液并風干。

1.3.5 競爭性酶聯免疫法（ELISA） 競爭性酶聯免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）根據Kamath等人[20]方法略有改動。富集TM用摩爾濃度50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）稀釋至質量濃度為4 μg/mL，4℃過夜包被，PBST溶液洗滌。然后用質量分數5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h，洗滌。每孔加入特異性單抗5G5E（與不同處理蝦仁樣品的TM粗提液混合反應后的特異性單抗），在37℃孵育2 h，洗滌。加入HRP-羊抗小鼠IgG（用抗體稀釋液稀釋2 500倍）37℃孵育2 h，洗滌。然后加入OPD底物顯色液室溫反應20 min，最后加入摩爾濃度為2mol/L硫酸終止反應，并立即用酶標儀測定490 nm處波長的吸光度值（OD值）。以摩爾濃度50 mmol/L的碳酸鹽溶液作為陰性對照，以抗體稀釋液稀釋的特異性抗體5G5E作為陽性對照，每個樣品做4個平行。樣品中TM的抑制率按照下述公式計算：

式中：R為樣品中TM的抑制率，（%）；A為樣品在490 nm處的吸光度值；A1為陽性對照樣品在490 nm處的吸光度值；A2為陰性對照樣品在490 nm處的吸光度值。

2 結果與分析

2.1抑菌處理對TM免疫活性的影響

SDS-PAGE能夠從電泳條帶中反映不同處理樣品蛋白質相對分子質量和濃度的變化。蛋白免疫印跡和競爭ELISA通過抗原抗體的特異性反應，能過評價過敏原免疫活性的變化，作者所采用單克隆抗體5G5E對甲殼類主要過敏原TM有特異性反應[21]。殼聚糖或者茶多酚溶液單獨與富集TM（400 μg/mL）混合反應后樣品的SDS-PAGE和Western-blotting結果如圖1所示，競爭ELISA結果如圖2所示。

由圖1可見，電泳結果顯示在3.5×104附近的條帶很粗，表明樣品中此相對分子質量的蛋白質有較高的含量。 Western-blotting結果（圖 1（b））顯示3.5×104附近的條帶與5G5E抗體有顯著的特異性反應，表明這個條帶是南美白對蝦的主要過敏原TM蛋白質。此外，與TM對照（樣品0）樣品相比，經不同濃度殼聚糖溶液（樣品1～5）和茶多酚溶液（樣品6～10）處理TM樣品的條帶粗細沒有變化，表明殼聚糖和茶多酚保鮮處理對富集TM的含量沒有影響。

圖1 抑菌處理的SDS-PAGE和Western-blotting結果Fig.1 SDS-PAG E and Western-blotting resultsof bacteriostasis treatments

由圖2可知，不同殼聚糖和茶多酚溶液抑菌處理TM樣品的抑制率均大于80%，其中茶多酚處理的富集TM樣品抑制率在83.10%～88.01%，殼聚糖處理的富集TM樣品抑制率在90.77%～95.77%，與對照相比抑制率無明顯變化（P＞0.05），說明不同濃度的殼聚糖和茶多酚溶液處理對純化南美白對蝦TM的免疫活性沒有影響。孫亞天等人[22]在大豆分離蛋白溶液中加入殼聚糖反應，結果發現大豆分離蛋白的分子結構未發生改變，而且酪氨酸和色氨酸殘基周圍的微環境沒有明顯改變。

圖2 抑菌處理的競爭ELISA結果Fig.2 Competition ELISA results for bacteriostasis treatments

2.2 酸性電解水結合烹飪處理對TM免疫活性的影響

酸性電解水結合水煮和清蒸烹飪處理的南美白對蝦蝦仁樣品的SDS-PAGE和Western-blotting結果分別如圖3和圖4所示，競爭ELISA結果如圖5所示。

圖3 酸性電解水結合水煮處理蝦仁樣品的SDS-PAGE和Western-blotting結果Fig.3 SDS-PAGE and Western-blotting of shrimp samples withAEWcombiningwithboilingprocess

由圖3（a）可知，以南美白對蝦蝦仁為對照（樣品0），酸性電解水浸泡不同時間的蝦仁（樣品1～3）TM條帶（3.5×104）粗細沒有變化；酸性電解水結合水煮（樣品 4～6）和單獨的水煮（樣品 7～9）處理的TM 條帶（3.5×104）也沒有顯著變化，但是在 18.4×104～25×104區域內，靠近2.5×104的條帶明顯減弱，而靠近18.4×104的條帶明顯增強，表明蝦仁經水煮加工后，大的蛋白質分子被分解產生小分子蛋白質。電解水結合水煮加工處理的免疫印跡結果 （圖3（b））顯示，與蝦仁對照（樣品0）相比，酸性電解水處理蝦仁（樣品1～3）的條帶沒有明顯變化，電解水結合水煮處理（樣品 4～6）及單獨的水煮處理（樣品 6～9）蝦樣的 TM 條帶有明顯減弱， 在 1.84×104～2.50×104范圍內的兩個條帶與TM特異性抗體不發生反應，表明水煮熱加工處理和電解水結合水煮處理能夠破壞TM的結構從而影響TM與特異性抗體的結合能力，而單獨酸性電解水處理樣品的TM的特異性反應條帶沒有變化。

圖4 酸性電解水結合清蒸處理蝦仁樣品的SDS-PAGE和Western-blotting圖Fig.4 SDS-PAGE and Western-blotting of shrimp samples with AEW combining with steaming process

由圖4（a）可知，單獨酸性電解水處理樣品（樣品 1～3）的 TM 條帶（3.5×104）沒有變化，而經過單獨清蒸（樣品7～9）以及酸性電解水結合水煮樣品（樣品4～6）的小分子條帶變粗，在4.5×104處出現新的大分子條帶；免疫印跡結果與酸性電解水結合水煮樣品結果相似。表明單獨酸性電解水處理對蝦仁中蛋白質組成沒有影響，而經過清蒸以及電解水結合清蒸蝦仁中小分子蛋白質濃度增加，同時出現少量大分子蛋白質。Liu[23]等人探究了水煮熱處理對蝦中TM的影響，研究發現水煮樣品中TM有相對較低的IgE結合能力和穩定性，同時SDS-PAGE結果顯示樣品中大分子蛋白質含量增加。酸性電解水處理對南美白對蝦的蛋白質組成和TM含量沒有影響，而水煮及清蒸熱加工處理能夠破壞TM結構改變構象，從而降低TM的含量，改變與特異性抗體的結合能力。

酸性電解水結合水煮或清蒸熱加工處理的南美白對蝦蝦仁樣品的競爭ELISA結果如圖5所示，抑制率與樣品中TM的免疫活性呈正相關。與蝦仁對照組相比，不同酸性電解水處理及結合水煮清蒸熱加工樣品的免疫活性出現下降的現象 （P＜0.05）。單獨酸性電解水處理10 min樣品的免疫活性下降14.1%，水煮及電解水結合水煮分別處理10 min的樣品TM免疫活性分別下降12.7%和12.9%，清蒸及電解水結合清蒸均處理15 min蝦仁的TM免疫活性降低更明顯，分別降低18.4%和15.7%。與單獨酸性電解水處理樣品相比，電解水結合清蒸熱加工樣品的免疫活性降低更為明顯，分別降低14.1%和18.4%，表明保鮮結合清蒸熱加工處理對TM的構象、空間結構和表位影響更加明顯。Marmon和Sun等人研究發現酸堿處理能夠改變魚蝦中氨基酸組成[24-25]，藺海鑫[26]用不同pH的酸性溶液處理從菲律賓蛤仔中富集純化的原肌球蛋白溶液，研究發現在酸性條件下原肌球蛋白的結構趨于松散，且表面疏水性明顯下降，而表面疏水性是由氨基酸在空間中分布造成的，與蛋白質的空間構象密切相關[11]。

圖5 酸性電解水結合熱加工樣品的競爭ELISA結果Fig.5 Competitive ELISA results of samples with AEW combining with thermal process

對比電解水結合不同加工處理的免疫印跡和競爭性ELISA結果，發現蝦仁經酸性電解水處理后，不同處理時間的過敏原TM和特異性單抗的反應基本沒有變化，但是競爭性ELISA結果顯示，蝦仁經酸性電解水處理5、10、15 min后，TM的免疫活性分別下降了4.8%、14.1%和6.2%，表明不同時間的酸性電解水處理對TM的免疫活性產生不同的影響。競爭性ELISA針對的是完整的蛋白質分子，故此它檢測到的是過敏原的構象表位；而蛋白免疫印跡針對的是三維結構破壞后的變性蛋白質，故此檢測到抗原的線性表位，而且某些攜帶抗原表位的小分子蛋白在轉膜過程中會丟失[11，27]， 從而導致Western-blotting和競爭ELISA結果出現不一致的現象，具體原因有待進一步驗證。

3 結語

作者通過對比研究殼聚糖、茶多酚以及酸性電解水抑菌處理對南美白對蝦主要過敏原TM的影響，發現酸性電解水抑菌處理能夠使TM免疫活性降低14.1%。同時發現酸性電解水結合清蒸處理可較弱的增強TM結構破壞，免疫活性降低15.7%。