獼猴桃糖蛋白及其去糖鏈蛋白功能特性的研究

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(1.河南工業大學糧油食品學院,河南鄭州 450001; 2.鄭州大學農學院,河南鄭州 450001)

獼猴桃,隸屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(ActinidiachinensisPlanch)[1],具有較高營養價值,除了含有豐富的維生素C和多酚類物質外,還含有蛋白質、碳水化合物、礦物質和不飽和脂肪酸,被譽為“水果金礦”,具有降血脂、抑制腫瘤細胞、提高人體免疫等功能[2]。

糖蛋白是生物體內重要的生物活性物質,具有一定的抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用[3-4]。糖蛋白分子上的糖鏈不僅影響其功能特性,也同樣影響其分子的高級結構和細胞間識別等生命活動[5],對細胞生物學[6]、蛋白質化學、生物技術及藥物開發都具有重要意義[7-8]。目前,蛋白質性質受糖基影響的研究主要涉及蛋白質的糖基化和糖蛋白的去糖基兩個方向。經糖基化反應,可提高綠豆蛋白清除DPPH自由基和羥自由基的能力[9],對于蛋白質維持啤酒泡沫穩定性方面起重要作用[10]。糖蛋白去糖基的方法主要有化學法、酶法和物理輔助法,去除糖基會改變糖蛋白的理化性質[11]和生物活性[12],目前的研究多集中于去糖基對酶活性的影響[13],而去糖基對糖蛋白功能特性的研究尚少。

本文通過比較在25～60 ℃范圍內溫度對獼猴桃糖蛋白(CGP)及其去糖鏈蛋白(GPP)吸油性、溶解性、起泡性和乳化性的影響,以及CGP、GPP的濃度及其溶液pH3～7.5和0～5 g/100 mL范圍的NaCl離子強度對CGP和GPP溶解性、起泡性和乳化性的影響的研究,揭示去糖鏈前后獼猴桃糖蛋白功能特性的變化,以期初步解析糖蛋白和去糖鏈蛋白功能特性的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華獼猴桃 市售;大豆油 益海嘉里集團;考馬斯亮藍G250 分析純,上海沃凱化學試劑有限公司;牛血清白蛋白 純度≥98%,北京奧博星生物科技有限公司;KBr、HCl 分析純,科密歐化學試劑有限公司。

RE2000旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-B95循環水式真空泵 河南鞏義予華儀器廠;DT5-4B型低速臺式離心機 北京時代北利離心機有限公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫康;MS-H280-Pro磁力攪拌器 SciLogex Co.,Ltd.;DFD-700恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-3CpH計 儀電科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CGP、GPP的制備 CGP為本實驗室制備獼猴桃糖蛋白(粗蛋白),CGP經β-消除反應后,濃縮,冷凍干燥,得到去糖鏈蛋白(GPP,糖含量未檢出)[14]。

1.2.2 溫度對CGP和GPP吸油性的影響 分別稱取CGP和GPP 0.6 g,置于離心管中,加入10 mL大豆油,混勻后分別置于室溫25、40、45、50、55、60 ℃水浴鍋中30 min,4000 r/min離心10 min,測量上清液體積,原始大豆油體積減去上清液體積,即為蛋白質樣品的吸油性[15],見式(1):

式(1)

其中,V為離心后上清液體積,mL。

1.2.3 溫度、pH、離子強度對CGP、GPP溶解性的影響

1.2.3.1 溫度對CGP和GPP溶解性的影響 CGP、GPP溶液分別置于溫度分別為25、40、45、50、55、60 ℃水浴中60 min后,4000 r/min離心10 min。測定上清液中蛋白質含量,用所得含量占樣品蛋白質含量的百分比來表示溶解度[16]。

1.2.3.2 pH對CGP和GPP溶解性的影響 CGP、GPP溶液分別用0.5 mol/L HCl調節pH為3、4、4.5、5、5.5、6、7.5后,4000 r/min離心10 min。測定上清液中蛋白質含量,溶解度表示方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 離子強度對CGP和GPP溶解性的影響 CGP和GPP分別用0、0.25、0.5、1、2、3、4、5 g/100 mL的NaCl溶液溶解后,4000 r/min離心10 min。測定上清液中蛋白質含量,溶解度表示方法同1.2.3.1。

1.2.4 濃度、溫度、pH、離子強度對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響

1.2.4.1 CGP和GPP濃度對其起泡性和泡沫穩定性的影響 參考涂宗財等的方法[17],并加以調整,分別稱0.5 g CGP、GPP,溶于50 mL蒸餾水中,分別制備濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液。分別使用磁力攪拌器混合均勻,測定泡沫高度并根據式(2)算出泡沫起泡性,穩定30 min后,再次測定泡沫高度,代入式(3)得泡沫穩定性。

式(2)

式(3)

1.2.4.2 溫度對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 將CGP和GPP溶液分別置于溫度分別為25、40、45、50、55、60 ℃水浴鍋中30 min后,分別使用磁力攪拌器混合均勻,測定泡沫高度,同1.2.4.1計算起泡性及泡沫穩定性。

1.2.4.3 pH對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 將CGP和GPP溶液分別用0.5 mol/L HCl調節pH分別為3、4、4.5、5、5.5、6、7.5后,分別使用磁力攪拌器混合均勻,測定泡沫高度,同1.2.4.1計算起泡性及泡沫穩定性。

1.2.4.4 離子強度對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 將CGP和GPP溶液離子強度分別調為0、0.25、0.5、1、2、3、4、5 g/100 mL。分別使用磁力攪拌器混合均勻,測定泡沫高度,同1.2.4.1計算起泡性及泡沫穩定性。

1.2.5 濃度、溫度、pH、離子強度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響

1.2.5.1 濃度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 參考張根生等的方法[18],并加以調整,分別稱取0.5 g CGP、GPP,溶于50 mL蒸餾水中,分別制備濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液。分別取5 mL CGP、GPP溶液,加入5 mL大豆油,均質2 min,2000 r/min離心5 min,記錄初始乳化層體積以及液體總體積,根據式(4)得出蛋白質乳化性,30 min后再以相同的轉速離心5 min,記錄乳化層體積以及液體總體積,并根據式(5)得出蛋白質乳化穩定性。

式(4)

式(5)

1.2.5.2 溫度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 將 CGP和GPP溶液分別置于溫度分別為25、40、45、50、55、60 ℃水浴鍋中30 min后,加入5 mL大豆油,均質2 min,2000 r/min離心5 min,記錄初始乳化層體積以及液體總體積,同1.2.5.1計算蛋白質乳化性及乳化穩定性。

1.2.5.3 pH對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 將CGP和GPP溶液分別用0.5 mol/L HCl調節pH分別為3、4、4.5、5、5.5、6、7.5后,加入5 mL大豆油,均質2 min,2000 r/min離心5 min,記錄初始乳化層體積以及液體總體積,同1.2.5.1計算蛋白質乳化性及乳化穩定性。

1.2.5.4 離子強度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 將CGP和GPP溶液離子強度分別調為0、0.25、0.5、1、2、3、4、5 g/100 mL,加入5 mL大豆油,均質2 min,2000 r/min離心5 min,記錄初始乳化層體積以及液體總體積,同1.2.5.1計算蛋白質乳化性及乳化穩定性。

1.3 數據處理

本文中所有實驗均平行測定三次,結果表示為平均值±標準偏差。并采用Origin 9.0處理數據、繪圖。

2 結果與分析

2.1 溫度對CGP、GPP吸油性的影響

CGP和GPP在不同溫度下吸油性的變化如圖1所示。由圖1可知,在25～60 ℃范圍內,CGP與GPP吸油性的變化趨勢相近,均為先升高再降低再升高的趨勢,不同溫度下的CGP吸油性始終高于GPP。CGP在60 ℃時吸油率達到最高,吸油率為3.1 mL/g,25 ℃時吸油率最低,吸油率為1.63 mL/g;GPP在45 ℃時吸油率達到峰值,吸油率為2.08 mL/g,分別在25、55 ℃吸油率最低,吸油率為0.65 mL/g。

圖1 CGP、GPP吸油性隨溫度變化Fig.1 The changes of CGP andGPP oil absorption with temperature

GPP為CGP去糖鏈的蛋白質,兩者分子上氨基酸的排列順序相同,由于CGP分子上糖鏈的存在,導致兩者在相同體系中空間結構的不同,CGP吸油性高于GPP的結果暗示CGP的空間結構會暴露更多的疏水性基團[19-20]。在25～45 ℃范圍內,隨溫度升高,兩者的吸油性均升高,表明在此溫度范圍,溫度升高使CGP與GPP的疏水基團暴露更多;在45～60 ℃范圍內,CGP吸油性于50 ℃達到最低值,再于60 ℃達到最高值,GPP于55 ℃達到最低值后吸油性又增加。這意味著此溫度范圍內,CGP和GPP分子的空間結構均有一個疏水性降低又升高的過程,由于糖鏈的存在,CGP更容易在較低溫度下發生疏水性的降低,疏水性升高的幅度大于GPP。

2.2 溫度、pH、離子強度對CGP、GPP溶解性的影響

2.2.1 溫度對CGP、GPP溶解性的影響 蛋白質的溶解度影響其界面性質,并對蛋白質在食品體系中的分子行為具有著重要的影響[21]。圖2為CGP、GPP溶解度隨溫度、pH、離子強度的變化。結果表明,隨溫度的增高(25～60 ℃),CGP和GPP的溶解度均下降,且CGP溶解度高于GPP的溶解度,這與CGP分子上具有親水性的糖鏈有關[22]。

圖2 CGP、GPP溶解性隨溫度、pH、離子強度的變化Fig.2 The changes of CGP and GPP solubilitywith temperature,pH,and ionic strength注:a:溫度;b:pH;c:離子強度。

2.2.2 pH對CGP、GPP溶解性的影響 隨著pH的增高(pH3～7.5),CGP的溶解度始終高于GPP,CGP、GPP兩種蛋白的溶解度出現先下降后上升的趨勢,CGP的溶解度最低點出現在pH4時,溶解度40.4%,GPP溶解度最低點出現在pH4.5,溶解度26.6%,這主要由于缺乏靜電推斥作用,疏水相互作用導致CGP和GPP的聚集[23]。

2.2.3 離子強度對CGP、GPP溶解性的影響 CGP、GPP的溶解度隨著離子強度增高而平緩下降,離子強度高于0.5 g/100 mL時,CGP和GPP的溶解度變化緩慢,這表明,在0～0.5 g/100 mL的離子強度范圍內,離子強度的增加改變了兩者的空間結構,導致兩者親水性的降低,離子強度高于0.5 g/100 mL之后,對于兩者分子空間結構的影響降低[24]。

2.3 濃度、溫度、pH、離子強度對CGP和GPP起泡性及泡沫穩定性的影響

2.3.1 濃度對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 圖3為CGP和GPP濃度對其起泡性和泡沫穩定性的影響。隨CGP、GPP濃度升高,兩者的起泡性均增高,且CGP起泡性高于GPP。濃度為0.4 mg/mL時,CGP和GPP的泡沫穩定性相同,高于和低于0.4 mg/mL時,GPP的泡沫穩定性高于CGP。這表明糖鏈的存在提高了CGP的起泡能力,使CGP分子更易于吸附至界面并在界面上重排;與GPP相比,濃度為0.4 mg/mL時糖鏈對泡沫穩定性沒有影響,在實驗范圍的其它濃度條件下,糖鏈的存在反而降低了泡沫穩定性。

圖3 蛋白質起泡性、泡沫穩定性隨濃度變化Fig.3 The changes of protein foaming and foam stability with concentration注:a:起泡性;b:泡沫穩定性;圖4～圖6同。

圖6 蛋白質起泡性、泡沫穩定性隨離子強度變化Fig.6 The changes of protein foamability,foam stability with solution ionic strength

2.3.2 溫度對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 圖4為溫度對對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響。隨著溫度的增高,CGP、GPP的起泡性先降低后升高,均于25 ℃時具有最高的起泡能力,起泡性分別為54.1%和37.6%,40 ℃時具有最低的起泡能力,起泡性分別為18.1%和15.1%;CGP和GPP的泡沫穩定性在25 ℃時最高,50 ℃時均具有最低的泡沫穩定性,泡沫穩定性分別為51.8%和18.4%。這與溫度升高導致兩者親水性降低與溫度升高導致的疏水基團的暴露有關,分子上親水性與疏水性的變化影響CGP和GPP吸附至界面的能力和界面重排的能力,從而影響了兩者的起泡能力[25]。

圖4 蛋白質起泡性、泡沫穩定性隨溫度變化Fig.4 The changes of protein foaming,foam stability with temperature

2.3.3 pH對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 圖5為CGP、GPP起泡性和泡沫穩定性隨pH變化情況。隨著pH的升高,CGP、GPP的起泡性先下降后上升,且CGP的起泡性始終高于GPP,兩者均于pH4時起泡性最低,起泡性分別為26.8%和2.4%,pH7.5時起泡性最高,起泡性分別為53.8%和37.4%。CGP、GPP泡沫穩定性大體呈先降低后升高的趨勢,CGP在pH3時泡沫穩定性最高,泡沫穩定性分別為78.8%,pH5時泡沫穩定性最低,泡沫穩定性分別為17.4%;pH4時GPP泡沫穩定性最低,泡沫穩定性為17.4%,pH7.5時GPP泡沫穩定性最高,泡沫穩定性分別為73.8%。這表明不同pH條件下,CGP、GPP分子上電荷分布的變化影響兩者的疏水性,從而影響兩者的起泡性和泡沫穩定性[26]。

圖5 蛋白質起泡性、泡沫穩定性隨pH變化Fig.5 The changes of protein foaming,foam stability with pH

2.3.4 離子強度對CGP和GPP起泡性和泡沫穩定性的影響 圖6為CGP、GPP起泡性和泡沫穩定性隨離子強度的變化。CGP、GPP的起泡性隨著離子強度變化趨勢有較大差異,其中CGP的起泡性隨著離子強度增高呈下降趨勢;GPP起泡性隨著離子強度的逐漸升高,呈現先下降后升高的趨勢,NaCl濃度為2 g/100 mL時,GPP起泡性最低,起泡性為9.8%。CGP、GPP的泡沫穩定性隨著離子強度變化趨勢有較大差異，隨著離子強度增高CGP的泡沫穩定性呈大幅度的先急劇增高后急劇降低再升高又下降增高的波動變化的趨勢，在NaCl濃度為1 g/100 mL時，CPP的泡沫穩定性最低為38.4%；GPP的泡沫穩定性隨著離子強度增高總體下降趨勢，泡沫穩定性在NaCl濃度為5 g/100 mL時，GPP的泡沫穩定性最低為48.4%。

2.4 濃度、溫度、pH、離子強度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響

2.4.1 濃度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 CGP、GPP乳化性和乳化穩定性隨濃度變化見圖7。由圖7可知,隨著濃度的增高,CGP、GPP的乳化性均增高,兩者均在1.0 mg/mL時乳化性最高,乳化性分別為32.4%和82.5% 0.2 mg/mL時乳化性最低,乳化性分別為12.4%和6.5%;CGP、GPP的乳化穩定性大體呈上升趨勢,兩者均在1.0 mg/mL時乳化穩定性最高,乳化穩定性分別為72.5%和73.4%、0.2 mg/mL時乳化穩定性最低,乳化穩定性分別為32.5%和50.4%;濃度高于0.8 mg/mL時,兩者的乳化穩定性相近,表明此濃度之上,糖鏈對溶液體系中分子構象的影響較小。

圖7 蛋白質乳化性、乳化穩定性隨濃度變化Fig.7 The charges of protein emulsification,emulsion stability with concentration注:a:乳化性;b:乳化穩定性;圖8～圖10同。

圖8 蛋白質乳化穩定性隨溫度變化Fig.8 The changes of protein emulsification,emulsion stability with temperature

圖10 蛋白質乳化性、乳化穩定性隨離子強度變化Fig.10 The changes of protein emulsification and emulsion stability changes with ionic strength

2.4.2 溫度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 圖8為CGP、GPP乳化性和乳化穩定性隨溫度的變化。隨溫度的增高,CGP乳化性先降低后升高,GPP乳化性先升高后降低,40 ℃時,CGP乳化性最低,乳化性為46.5%,而GPP的乳化性最高,乳化性為41.4%;CGP和GPP的乳化穩定性隨溫度升高先升高后降低,50 ℃時CGP乳化穩定性最高,乳化穩定性為88.5%,45 ℃時GPP乳化穩定性最高,乳化穩定性為78.4%,60 ℃時CGP和GPP的乳化穩定性均最低,乳化穩定性分別為16.5%和47.4%。表明不同溫度時,糖鏈的存在主要影響乳化性,在25～60 ℃范圍內可提高乳化性和乳化穩定性,這主要由于糖鏈的存在提高了CGP的親水性,提高了分子的柔性,利于CGP分子吸附于界面并在界面上的重排[27]。

2.4.3 pH對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 圖9為CGP、GPP乳化性和乳化穩定性隨pH的變化。隨pH的增高,CGP、GPP的乳化性為先下降后上升的趨勢,且CGP的乳化性始終高于GPP,CGP、GPP乳化性最低點均出現在pH4.5,乳化性分別為14.5%和3.4%,pH的變化對CGP乳化性的影響高于對GPP的影響,表明在低于和高于pH4.5條件下,糖鏈的存在促進了蛋白質的乳化性。隨pH的增高,CGP、GPP的乳化穩定性均先降低再升高,pH3時CGP的乳化穩定性最高,乳化穩定性為88.5%,pH4.5時CGP的乳化穩定性最低,乳化穩定性為56.5%;pH4時GPP的乳化穩定性最低,乳化穩定性為33.5%,pH7.5時GPP的乳化穩定性最高,乳化穩定性為60.5%;pH7.5時CGP和GPP的乳化穩定性相同,表明pH7.5時,糖鏈對乳化穩定性的影響較小[28]。

圖9 蛋白質乳化性、乳化穩定性隨pH變化Fig.9 The changes of protein emulsification,emulsion stability with pH

2.4.4 離子強度對CGP和GPP乳化性及乳化穩定性的影響 圖10為CGP、GPP乳化性和乳化穩定性隨離子強度的變化。CGP、GPP乳化性隨著離子強度增高變化趨勢差別較大,其中CGP的乳化性隨著離子強度增高而逐漸降低,NaCl濃度在0～1 g/100 mL范圍內,CGP的乳化性快速下降,1～5 g/100 mL范圍內,CGP的乳化性緩慢下降;GPP的乳化性隨著離子強度增高先增高后下降,NaCl濃度為2 g/100 mL時,GPP的乳化性最高,NaCl濃度5 g/100 mL時,CGP和GPP乳化性均最低;NaCl濃度為0～2 g/100 mL時,CGP與GPP的乳化性呈相反趨勢,超過2 g/100 mL時,兩者均呈下降趨勢,這表明在此范圍內,隨離子強度的增加,糖鏈的存在會降低分子在界面的吸附能力,導致乳化性的降低[21]。NaCl濃度0～0.25 g/100 mL,CGP乳化穩定性急劇降低,糖鏈存在條件下,離子強度的變化對分子親水性和疏水性的影響較大,從而影響界面的吸附膜的穩定性[21];0.25～2 g/100 mL主要在15%附近波動,表明此條件下,糖鏈的存在對分子在界面上形成吸附膜的影響較小[23];2～5 g/100 mL范圍內,乳化穩定性先增高后下降,峰值位于NaCl濃度為3 g/100 mL處。NaCl濃度0～2 g/100 mL范圍內,GPP的乳化穩定性為快速下降趨勢;3～5 g/100 mL時,GPP乳化穩定性呈現先升高后降低趨勢,峰值位于4 g/100 mL。

3 結論

在25～60 ℃的范圍內,CGP吸油性明顯高于GPP,去糖鏈處理降低了獼猴桃糖蛋白的吸油率。隨溫度的升高,CGP、GPP溶解度均下降,隨pH增高(pH=3～6),CGP、GPP溶解度先下降后上升,隨著離子強度增高,CGP、GPP溶解度平緩下降,GPP的溶解度始終低于CGP,去糖鏈處理明顯降低了獼猴桃糖蛋白的溶解性。

CGP、GPP起泡性、泡沫穩定性、乳化性、乳化穩定性等性能明顯受溫度、pH、離子強度等條件的影響;去糖鏈處理對獼猴桃糖蛋白的起泡性、泡沫穩定性、乳化性和乳化穩定性等性能產生明顯影響,但在不同的溫度、pH、離子強度環境條件中去糖鏈處理影響獼猴桃糖蛋白質的趨勢并不相同。