白蘇葉乙醇提取物體外抗氧化活性評價及相關性分析

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(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134; 2.天津天獅學院食品工程學院,天津 301700)

白蘇(Perillafrutescens(L.)Britt)系唇形科紫蘇屬紫蘇植物的近似種,全株密被白色柔毛,葉片背面呈白色[1-2]。白蘇在我國各地均有種植,葉可直接食用或作為調味料用于肉類的增香,種子可用于榨取食用油。白蘇具有抑菌、抗氧化、抗衰老等作用[1-2]。關于白蘇化學成分的研究甚少,遠遠不及同樣資源豐富的紫蘇[3-5],且其研究主要集中在莖葉中所含的揮發油[6-11],對于白蘇黃酮類物質的報道甚少。王靜等[12]發現白蘇葉黃酮類物質清除超氧陰離子自由基、過氧化氫及抑制豬油氧化的能力均略強于紫蘇葉黃酮。本課題組此前的工作中,優化了黃酮類的微波輔助提取條件,從白蘇葉的乙醇提取物(WPEE)中鑒定出了13種化合物,主要成分為迷迭香酸(74.94 μg/mg)、野黃芩苷(50.08 μg/mg)、檸檬酸(47.94 μg/mg)和芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷(41.08 μg/mg)[13-14]。

抗氧化劑通常是具有還原性和自由基清除能力,可以減弱、抑制甚至消除氧化反應的一類物質[15]。隨著人們對食品安全的要求日漸提高,相比人工合成抗氧化劑,人們更關注較為安全的天然抗氧化劑。而現階段的研究表明,任何一種單一的評價方法均無法充分地評價樣品的抗氧化活性[16-17]。而不同的抗氧化評價方法之間所得的結果是否具有相關性未見報道,因此使用不同的方法從不同的角度對樣品的抗氧化活性和清除自由基的能力進行研究并解釋不同評價方法的相關性是非常必要的。

本文采用六種方法即細胞內活性氧清除能力(CAA)、總抗氧化活性(TAA)、清除超氧陰離子自由基(SSAR)、清除羥自由基(SHR)、清除二苯基苦基苯肼自由基(SDR)能力以及抑制卵黃脂蛋白脂質過氧化(ILLP)能力來評價WPEE的抗氧化活性。探討利用這六種方法評價抗氧化活性的可行性,以及這些方法與WPEE中活性成分含量的關系,借以揭示不同的抗氧化性評價方法之間的內在聯系,為白蘇資源作為天然抗氧化劑替代人工合成抗氧化劑方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蘇葉 河北省安國市,粉碎、過篩(20目);RAW264.7巨噬細胞 美國模式培養物集庫存;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 美國Gibco公司;無血清高糖培養基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)及青霉素、鏈霉素抗體 美國Hyclone公司;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 中國醫學科學院血液研究所;活性氧檢測試劑盒 江蘇碧云天生物科技有限公司;二苯基苦基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;其余試劑 均為國產分析純。

DS-5MC倒置顯微鏡 日本尼康公司;SpectraMax M5多功能讀板機 美國分子器件公司;HERAcell 240i二氧化碳培養箱 美國熱電公司;Lambda 25紫外-可見分光光度計 美國珀金埃爾默公司;H2050R-1醫用離心機 湖南湘儀離心機儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白蘇葉乙醇提取物(WPEE)的制備 按照文獻[13-14]的方法,采用微波輔助提取法對白蘇葉粉末進行提取(提取條件為:乙醇濃度63%、液料比41∶1 mL∶g、微波溫度72 ℃、提取時間7 min以及微波功率500 W),并利用AB-8大孔樹脂進行純化,冷凍干燥后獲得白蘇葉醇提物粉末備用。使用甲醇配制4 mg/mL的白蘇葉醇提物樣品液,經制備色譜分離純化初步得到2個組分(以下簡稱F1和F2),貯于陰涼干燥處備用。

1.2.2 細胞內活性氧清除能力(CAA)的測定 利用DMEM將WPEE、F1和F2分別配制成1.0 mg/mL的儲備液,0.2 μm濾膜過濾除菌后,冰箱冷藏4 ℃儲存備用。實驗前利用DMEM將儲備液適當稀釋得到濃度為0.001、0.1和0.5 mg/mL的工作液。

首先,為選擇細胞抗氧化活性測定時合適的WPEE的濃度,運用MTT比色法測定不同濃度下的細胞存活率[18]。將RAW264.7細胞置于DMEM培養基[含10% FBS、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)],37 ℃、5% CO2條件下培養至對數生長期。將對數生長期的RAW264.7細胞以1×105個/孔的密度接種于白色透明96孔板,37 ℃、5% CO2條件培養24 h后,吸除上述DMEM培養基并使用磷酸緩沖液(PBS,0.85% NaCl,2.68 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4和1.76 mmol/L KH2PO4)沖洗3次。再向每孔中加入100 μL濃度為0.001、0.1和0.5 mg/mL的WPEE、F1或F2溶液,不同濃度的所有樣品均設六個復孔,再培養24 h后,加入20 μL 5.0 mg/mL MTT再培養4 h,吸除液體后向每孔加入100 μL二甲基亞砜用以溶解藍紫色甲瓚結晶,置于多功能讀板機低速振蕩以助溶解,并利用讀板機讀取570 nm處吸光度值ODx;空白組為每孔不接種細胞,以DMEM培養基替代樣品,讀取吸光度值記為OD0;而對照組為每孔接種細胞,同樣以DMEM培養基替代樣品,讀取吸光度值記為ODc。細胞的存活率(%)由式(1)計算:

式(1)

然后,采用DCFH-DA探針法測定細胞內熒光強度。接種細胞于黑色96孔板(底部透明),培養24 h后吸除上述DMEM培養基并使用PBS沖洗3次。再向每孔加入100 μL 10 μmol/L DCFH-DA探針和100 μL 0.1 mg/mL WPEE(上述細胞存活率實驗證明此濃度的黃酮對細胞存活率無影響),培養30 min后吸除液體,再使用PBS沖洗,最后加入100 μL 100 μmol/L H2O2,每隔5 min測定上述液體1 h內熒光強度的變化(激發波長和發射波長分別為488和525 nm)。空白組為加入探針但不加WPEE和H2O2的孔,對照組為加入探針和H2O2但不加入WPEE的孔。一方面,DCFH-DA探針可自由進出細胞,活細胞酯酶可分解DCFH-DA生成還原性的DCFH,產物DCFH無法穿透細胞膜,故滯留于細胞內;另一方面,細胞內的活性氧(ROS)可在H2O2的刺激下增多,H2O2亦可自發產生更多的ROS,ROS將還原性的DCFH氧化成熒光物質DCF,其熒光強度可間接反映細胞內ROS水平,并可間接評價樣品的細胞內抗氧化能力[19-20]。故細胞內抗氧化活性的測定可通過測定DCF熒光強度實現,分別以時間和熒光強度為橫、縱坐標繪制曲線,CAA可由式(2)計算:

式(2)

1.2.3 總抗氧化活性(TAA)的測定 參照文獻[16,21-22]所使用的磷鉬絡合物法測定WPEE的TAA。首先將WPEE、F1、F2及VC溶液配制成濃度0.1～0.3 mg/mL的樣品待測液,其次將0.4 mL的樣品待測液與4.0 mL的磷鉬試劑(鉬酸銨、磷酸鈉和硫酸終濃度分別為4.0、28.0和0.6 mmol/L)混勻于水浴95 ℃恒溫反應90 min,測定695 nm處吸光度A695 nm。所有測定均平行重復3次,以下同(細胞抗氧化實驗除外)。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基(SSAR)能力的測定 參照文獻[23-24]利用鄰苯三酚自氧化動力學法測定WPEE的SSAR。首先進行全波長掃描確定鄰苯三酚在堿性條件下(Tris-HCl緩沖液pH8.2,濃度0.05 mol/L)的最大吸收波長為320 nm。在相同堿性條件下,將濃度為0.1～0.3 mg/mL WPEE、F1和F2或VC的樣品液各1.5 mL分別加入0.5 mL 3.0 mmol/L鄰苯三酚溶液和2.5 mL蒸餾水(上述反應試劑均提前37 ℃恒溫水浴20 min),每隔1 min測定320 nm處吸光度值A320 nm。以A320 nm為縱坐標,反應時間為橫坐標作圖,所得直線的斜率為添加樣品后的鄰苯三酚的自氧化速率Vs。而將樣品液替換為蒸餾水進行上述操作,作圖所得的斜率為鄰苯三酚本身的自氧化速率V0。SSAR由式(3)計算:

式(3)

1.2.5 清除羥自由基(SHR)能力的測定 參照文獻[25]利用水楊酸法測定WPEE的SHR。利用Fenton反應亞鐵離子(Fe2+)與過氧化氫反應生成OH-自由基,而OH-自由基與水楊酸反應生成有色物質,在510 nm處有特征吸收,當加入OH-自由基清除劑時與水楊酸形成競爭關系,減少有色物質的生成量,從而降低吸光度值。取若干支比色管,首先加入1.0 mL 10 mmol/L硫酸亞鐵溶液(由煮沸放冷的蒸餾水及稀硫酸配制)和2.0 mL 5 mmol/L水楊酸,再分別加入1 mL濃度為0.1～0.5 mg/mL的WPEE、F1、F2或VC的樣品液,最后加入2.0 mL 0.03% H2O2混勻,置于恒溫水浴37 ℃、30 min后測定A510 nm。其中,An為加入樣品液時所得吸光度值,以蒸餾水替代樣品液時為空白對照液吸光度值A0,不添加H2O2時樣品溶液的本底吸光度值為A′n。SHR由式(4)計算:

式(4)

1.2.6 清除DPPH自由基(SDR)能力的測定 參照文獻[26-27]測定WPEE的SDR。DPPH自由基被還原時,顏色會由紫色褪至淡黃色,故可通過測定加入抗氧化物質后517 nm處吸光度A517 nm的變化即可計算DPPH自由基的清除率。首先,配制濃度為0.02～0.10 mg/mL的WPEE、F1和F2以及VC樣品溶液。取0.5 mL上述樣品液與3.5 mL 1.0×10-4mol/L DPPH混勻避光反應30 min后測定吸光度值A517 nm;0.5 mL樣品液與3.5 mL無水乙醇混勻后測定空白吸光度值為A0;0.5 mL無水乙醇與3.5 mL 1.0×10-4mol/L DPPH混勻后測定對照吸光度值為A1。SDR由式(5)計算:

式(5)

1.2.7 抑制卵黃脂蛋白脂質過氧化(ILLP)能力的測定 Fe2+能夠誘發卵黃磷脂C-2位上的低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)以及多不飽和脂肪酸(PUFA或稱為過不飽和脂肪酸)的過氧化,此模型可運用于WPEE抗氧化能力的測定。按照文獻[28]方法并略作改進。首先取新鮮雞蛋的卵黃與0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7.45)1∶1 (v∶v)磁力攪拌混勻,再使用該PBS稀釋25倍,制得卵黃懸液冷藏4 ℃儲存待用。取0.2 mL卵黃懸液,加入0.6 mL 0.1 mg/mL的WPEE、F1和F2或VC樣品液,0.2 mL 25 mmol/L FeSO4溶液及1.0 mL PBS混勻,37 ℃培養12 h后加入0.5 mL 20%三氯乙酸,混勻靜置10 min,離心10 min(3500 r/min)。分別吸取2.0 mL上清加入1.0 mL 0.8%硫代巴比妥酸(TBA)混勻,沸水浴15 min,冷卻后于532 nm測定樣品吸光度值Ab。以蒸餾水代替樣品經上述操作,測定對照吸光度值A0。ILLP以抑制率表示:

式(6)

1.3 統計分析

所有實驗測定均重復3次,測定結果以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示。采用SPSS 16.0統計軟件對不同方法測定的WPEE、F1、F2以及VC的抗氧化性及清除自由基的數據進行單因素方差統計分析,進一步使用SPSS對不同測定方法所得白蘇葉黃酮抗氧化活性及清除自由基能力、白蘇葉黃酮含量百分比進行皮爾森相關性分析。

2 結果與分析

2.1 WPEE、F1和F2對細胞內活性氧清除能力(CAA)的影響

2.1.1 WPEE濃度的選取 細胞內抗氧化活性測定時需在不影響細胞存活前提下進行,故需要選擇合適的WPEE濃度。故測定不同濃度的WPEE、F1和F2對RAW264.7細胞存活率的影響,實驗結果如圖1所示。MTT可與活細胞的琥珀酸脫氫酶反應生成藍色的甲瓚結晶,于可見光處有吸收;相反,死細胞不具有此種還原酶無法將MTT還原[29]。活細胞數量與甲瓚結晶生成量成正比,故測定吸光度值的高低可以間接反映活細胞的數量。圖1顯示當WPEE、F1和F2濃度低于0.5 mg/mL時,對RAW264.7細胞存活率均無影響;當樣品液濃度為0.001時對細胞內自由基的清除率較低或效果不明顯,而當樣品液濃度較高時,WPEE相對浪費,故測定CAA時,WPEE、F1和F2濃度均選取中間濃度0.1 mg/mL。

圖1 WPEE、F1和F2對細胞存活率的影響Fig.1 Effects of WPEE,F1 and F2 on the cell viability注:NS代表相同濃度下WPEE和不同組分的細胞存活率無顯著性差異(P>0.05)。

2.1.2 細胞內熒光強度的測定結果 WPEE、F1和F2(濃度均為0.1 mg/mL)對RAW264.7細胞熒光強度的影響如圖2所示。DCFH-DA本身無熒光,經酯酶水解生成的DCFH可被ROS氧化成具有熒光的DCF,熒光強度越高,說明ROS含量越多,當ROS清除劑存在時,ROS含量減少則熒光強度降低,故熒光強度的測定可間接反應出樣品的CAA大小[20]。由圖2可知,與對照組相比,WPEE、F1和F2均可極顯著降低DCF熒光強度(P<0.01),證明了WPEE、F1和F2均具有清除細胞內ROS的能力,具有良好的細胞內抗氧化效果。其中,熒光強度越低代表樣品所清除的ROS含量越多,F2組的熒光強度降低最多,WPEE次之,F1降低最少,故可得出在細胞內清除ROS的能力依次為F2>WPEE>F1。

圖2 WPEE、F1和F2對DCF熒光強度的影響Fig.2 Effects of WPEE,F1 and F2on the fluorescence intensity of DCF注:圖中不同小寫字母代表反應時間為1 h時不同樣品組的DCF熒光強度差異極顯著(P<0.01)。

2.1.3 CAA值測定結果 利用上述曲線的積分面積及公式(6)計算可得WPEE、F1和F2在RAW264.7細胞CAA值(圖3)。在濃度為0.1 mg/mL時,WPEE、F1及F2均具有一定的抗氧化活性,且抗氧化效果差異極顯著(P<0.01),由高到低依次為F2>WPEE>F1。這主要是由于F1和F2的主成分中含有檸檬酸和迷迭香酸[14],后者比起前者結構上具有多個酚羥基,而這些酚羥基通常是自由基清除的主要作用基團[30]。上述結果說明WPEE及其成分不僅在體外可以清除自由基,亦可以進入細胞內清除ROS,在細胞內亦能夠發揮良好的抗氧化效果。

圖3 WPEE、F1和F2對RAW264.7細胞內抗氧化活性單位(CAA)的影響Fig.3 Effects of WPEE,F1 and F2 on the cellularantioxidant activity(CAA)units in RAW264.7 cells注:圖中不同小寫字母代表相同濃度下WPEE和不同組分的細胞內抗氧化活性單位(CAA)差異極顯著(P<0.01)。

2.2 WPEE、F1和F2的總抗氧化活性(TAA)

WPEE、F1和F2以及VC的TAA的測定結果如圖4所示。樣品液濃度與吸光度成正相關,且在測試濃度范圍內(0.1～0.3 mg/mL)TAA大小順序為:VC>F2>WPEE>F1。根據白蘇葉成分的研究結果[14]可知,F1和F2的主成分中含有檸檬酸和迷迭香酸,且各占其組分含量的28%和41%,此外,F1和F2含黃酮類物質約為39%和53%。檸檬酸供氫能力較弱,是常見的金屬螯合劑,而迷迭香酸以及黃酮類物質均具有多個酚羥基結構,故F2比F1具有更好的抗氧化活性。

圖4 WPEE、F1和F2以及VC的總抗氧化活性(TAA)Fig.4 Total antioxidant activities(TAA)of WPEE,F1,F2 and Vc注:圖中不同小寫字母代表樣品液濃度為0.30 mg/mL時不同樣品的總抗氧化活性(TAA)差異極顯著(P<0.01)。

2.3 WPEE、F1和F2清除超氧陰離子自由基(SSAR)的能力

圖5 WPEE、F1和F2以及抗壞血酸(VC)對超氧陰離子自由基的清除率rate of WPEE,F1,F2 and VC注:圖中不同小寫字母代表相同濃度下不同樣品的超氧陰離子自由基的清除率差異極顯著(P<0.01);不同大寫字母代表相同樣品不同濃度下的超氧陰離子自由基的清除率差異極顯著(P<0.01)。

2.4 WPEE、F1和F2清除羥自由基(SHR)的能力

WPEE、F1和F2以及VC在不同濃度下對羥自由基清除率的測定結果如圖6所示。在濃度范圍0.1～0.5 mg/mL時,樣品對羥自由基的清除能力均具有濃度依賴性,濃度增加清除率升高,且WPEE和F2清除率甚至超過VC,當濃度為0.5 mg/mL時,清除能力依次為F2>WPEE>VC>F1,F2的清除率接近50%而VC僅達到36.75%。黃酮類化合物結構上具有酚羥基,而這些酚羥基是發揮羥自由基清除能力的主要作用基團,且酚羥基數目與清除能力成正相關[30]。F2中含量最高為迷迭香酸占41%,其次是野黃芩苷占27%[14]。迷迭香酸是酚酸類物質,具有多個酚羥基故具有良好的羥自由基的清除能力[31];而野黃芩苷結構上于A環具有5-和6-OH,C環具有4′-OH,對羥自由基亦具有良好的清除能力。本研究結果中F2具有更高的羥自由基清除能力亦證明了此結論。

圖6 WPEE、F1和F2以及抗壞血酸(VC)對羥自由基(OH-·)的清除率Fig.6 Hydroxyl radicals(OH-·)scavengingrate of WPEE,F1,F2 and VC注:圖中不同小寫字母代表樣品液濃度為0.5 mg/mL時不同樣品的羥自由基清除率差異極顯著(P<0.01)。

2.5 WPEE、F1和F2清除DPPH自由基(SDR)的能力

WPEE、F1和F2以及VC對DPPH自由基清除率測定結果如圖7所示。在濃度范圍0.02～0.10 mg/mL時,樣品對DPPH自由基的清除能力均隨著濃度的升高而增加。當樣品濃度為0.10 mg/mL時,清除能力依次為VC>F2>WPEE>F1(P<0.01),其中F2對DPPH自由基的清除率較高,亦證明了F2主要成分迷迭香酸及黃酮類化合物的結構上所具有的酚羥基有助于自由基的清除。

圖7 WPEE、F1和F2以及抗壞血酸(VC)對DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH free radicals scavengingrate of WPEE,F1,F2 and Vc注:圖中不同小寫字母代表樣品液濃度為0.10 mg/mL時不同樣品的DPPH自由基清除率差異極顯著(P<0.01)。

2.6 WPEE、F1和F2抑制卵黃脂蛋白脂質過氧化(ILLP)的能力

WPEE、F1和F2以及VC抑制卵黃脂蛋白脂質過氧化能力的測定結果如圖8所示。在相同濃度0.1 mg/mL時,VC與WPEE各組分對脂質過氧化均有抑制效果,其中F2和WPEE的抑制率分別達到了72.40%和68.04%,均極顯著高于VC的54.02%(P<0.01),但F1的抑制率較低,為23.03%。該反應模式是利用Fe2+誘發卵黃脂蛋白的PUFA更易產生脂質過氧化[32],而黃酮類化合物具有抑制脂蛋白PUFA的脂質過氧化功能,本研究中WPEE對該脂質過氧化的抑制率高于70%的結果亦證明了此結論:F2脂質過氧化抑制率最高主要是因其主成分(迷迭香酸和野黃芩苷)的酚羥基數量多,易與自由基反應;相反地,F1抑制率低是由于其第一主成分是檸檬酸無酚羥基,且第二主成分芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷[14]具有C-6,8位碳糖苷,已有研究表明,此糖苷對黃酮的抗氧化活性及清除自由基能力具有不利影響[33]。故WPEE的F1和F2抑制脂質過氧化能力差距較大。

圖8 WPEE、F1和F2以及VC對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率Fig.8 Inhibition rate of yolk lipoproteinperoxidation of WPEE,F1,F2 and VC注:圖中不同小寫字母代表相同濃度下不同樣品對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率極顯著(P<0.01)。

2.7 相關性分析

表1 抗氧化活性及清除自由基能力、WPEE相對含量的皮爾森相關系數Table 1 Pearson’s correlation coefficients among antioxidant activities,free radical scavenging activities and relative content of WPEE

3 結論

本研究結合六種不同體系對WPEE體外抗氧化活性及清除自由基能力進行評價。對于黃酮抗氧化活性的正確評價需要結合其理想濃度,因為不同體系所使用的方法原理、靈敏度、特征性均不一致,故每種體系所使用的黃酮濃度均是不同的。獨立的測定方法、不同濃度、不同組分的測定結果全面評價了WPEE的抗氧化活性和清除自由基能力。六種評價方法均證實WPEE有明顯的抗氧化活性,其中TAA、SSAR和SDR活性順序均為:VC>F2>WPEE>F1,但SHR及ILLP活性順序為:F2>WPEE>VC>F1。綜上所述,WPEE作為天然抗氧化劑完全有潛力代替人工合成抗氧化劑應用于食品工業,天然、安全、無污染。未來的研究熱點可能包括建立一整套操作成本低廉、簡便、結果可靠且較為全面的測試方法所構成的植物天然抗氧化性能評價標準與體系。