基于傳統培養和高通量測序方法分析羊肉加工過程中的菌群多樣性

,2,*,2

(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014; 2.青海省青海湖肉業有限責任公司,青海海南州 813000)

肉的腐敗變質主要是由于微生物的污染和酶的作用,其中微生物的入侵和大量繁殖是造成肉質腐敗的主要原因。從屠宰到加工微生物的來源廣泛而多樣,甚至可以造成交叉污染,因此控制肉品質量保證其安全性的首要條件是防止微生物的污染繁殖,而在微生物繁殖中控制微生物中優勢腐敗菌的生長繁殖,是對肉品進行保鮮的有效手段。抑制腐敗菌的生長首先就要控制其生物膜的形成量,這對優勢腐敗菌尤為重要,生物膜是細菌繁殖并不斷聚集形成的一種保護膜,生物膜的存在使得細菌對殺菌劑(抗生素等)、宿主自身的免疫機制甚至是惡劣的環境都有很大的抵抗性。生物膜的這一特點,使抗生素對細菌治療效果大打折扣[1],尤其是一些引發慢性感染疾病的致病菌更難治愈[2]。近年來對肉品中優勢腐敗菌的研究也越來越多,王寧[3]研究表明,冷卻羊肉的腐敗菌中,假單胞菌作為優勢菌群占了約30%,此外腸桿菌、乳酸菌、葡萄球菌等腐敗菌也常作為羊肉中的優勢菌群,但所占比例在各類文獻中略有不同。傅鵬等[4]發現冷卻豬肉的初始菌相中也是假單胞菌屬占優勢。對肉的保鮮技術不斷改進并延長其貨架期一直是肉品研究的熱點,較為傳統的方法是通過低溫、真空包裝、氣調包裝[5]等延緩微生物的生長繁殖,李月明等[6]研究了生物可降解膜對肉品的保鮮作用,楊玉紅[7]則利用了乳酸菌的低pH及其代謝產物(細菌素和類細菌素)來進行保鮮。

高通量測序法近來作為一種新的分子生物技術,具有通量高、準確率高、速度快的特點[8-10],能對整個樣品中的微生物種類和相對數量有一定的分析,更完整地體現微生物的群落特征[11]。目前高通量測序被廣泛應用于食品加工[12-13]和微生物體系如泡菜、白酒、奶酪等[14-16]的檢測,甚至在檢測腸道微生物[17-19]和水土中相關樣品[20-21]中也有應用。

本實驗擦取了屠宰至加工包裝的各個過程中羊胴體表面及其能接觸到的臺面上的細菌,研究整個流程中羊肉表面的優勢菌群及各菌株的成膜能力。旨在利用傳統分離菌落方法和高通量測序法研究羊肉胴體表面的優勢菌,并利用結晶紫染色研究各菌株的成膜能力,為下一步羊肉產品的抑菌保鮮提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 從羊胴體表面及所接觸臺面擦拭所得的菌樣;營養瓊脂(Nutrient Agar)、營養肉湯(Nutrient Broth,NB)、假單胞菌分離瓊脂(Pseudomonas Isolation Agar)、假單胞分離肉湯(Pseudomonas Isolation Broth)、胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Broth)、月桂酸硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(Lauryl Sulfate Tryptose Broth,LST)、MRS培養基(MRS Medium)、MRS肉湯(MRS Broth) 北京路橋技術有限責任公司;甘露醇氯化鈉瓊脂(Mannitol Salt Agar)、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(Violet Red Bile Glucose Agar,VRBGA) 北京奧博星生物科技有限責任公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

酶標儀 美國BioTek儀器公司;22331臺式高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司(Eppendorf AG);TP600梯度升降溫功能PCR儀 日本Takara Bio Inc.;變性梯度凝膠電泳系統 上海培清科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌落總數測定 本實驗選取九個取樣點,其中羊胴體表面選取三處,分別為開膛前、開膛后、沖洗后,每個取樣點取三只羊胴體,每只胴體三個平行面。其余的取樣點為沖洗的臺面、分割羊肉的臺面兩個、案板、分離內臟后沖洗用水、燙毛用水,每個取樣點三個平行。將棉簽在(5×5) cm2的取樣器范圍內擦拭,將沾有菌落的棉簽放入裝有225 mL無菌水的均質袋中振蕩混合均勻,取1 mL混合均勻的菌液移入培養皿,然后倒入PCA固體培養基待其凝固之后倒置培養24～48 h至菌體長出計數。

1.2.2 菌種的分離與保存 把原始菌液稀釋到一定梯度,取100 μL涂布在PCA板和選擇性培養基平板上培養24～48 h,從各平板中挑取菌落密度分布比較均勻的、呈單菌落的不同菌株再次對應不同的選擇性液體培養基在37 ℃恒溫振蕩培養,然后繼續平板涂布、液體培養,至少重復純化三次。最終將分離純化完成的菌液與50%(v/v)的無菌甘油以1∶1的比例混合均勻置于-80 ℃冷凍保存。

1.2.3 分離菌種鑒定 將從1.2.2中分離出的43株菌的菌液過夜培養,各取1 mL離心收集細菌,用100 μL滅菌的超純水重懸然后100 ℃水浴加熱10 min使細胞膜破碎,繼續在4 ℃下10000 r/min離心10 min,取上清液作為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為40 μL,其中2×Master Mix為20 μL、超純水14 μL、引物27F和1492R各2 μL、模板2 μL。PCR擴增完成后,取5 μL擴增后的樣品和1 μL buffer混合均勻進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將能顯示出清晰條帶的PCR擴增產物和未顯示出條帶的菌液送至上海生工生物技術有限公司,所用引物為27F和1492R(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′)。所得的測序序列結果用Blast進行對比,并選取同源性最高的菌株序列,鑒定出菌種類型并利用其序列構建系統進化樹。

1.2.4 菌株成膜能力比較 將從1.2.2中分離出的43株菌株按1%的接種量接種到無菌的NB液體培養基中,混合均勻后取200 μL菌液加入96孔板,對照組為不加入菌液的液體培養基,37 ℃培養24 h。取培養好的樣品,首先在570 nm處測定吸光值,此時對照組和實驗組的吸光值用OD1和OD11表示。然后吸除上層培養基并用0.01 mol/L的PBS洗三次后干燥。每孔加入200 μL 1%的結晶紫染色5 min,吸除染液PBS洗三次,干燥后加入200 μL 95%的乙醇30 min,測其570 nm處的吸光值,對照組和實驗組的吸光值用OD2和OD22表示。菌株成膜能力用B值表示,B值=(OD22-OD2)/(OD11-OD1)。

1.2.5 DNA的提取和PCR擴增 取未稀釋的初始樣品,12000 r/min低溫離心15 min收集菌體沉淀。DNA的提取參照DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)的說明書方法進行。以提取的DNA作為模板,以338F和806R(5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3′,5′-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3′)作為引物對細菌的16S rDNA V3-V4區進行序列擴增。

1.2.6 高通量測序 將初步處理的樣本委托北京奧維森基因科技有限公司,利用其Illumina Miseq PE300高通量測序平臺測序。通過MiSeq平臺測序得到的數據,依據所得的PE reads之間的overlap關系將reads進行拼接,并根據各樣品數據對序列采用質量控制和過濾[22],去除嵌合體和序列末端低于20質量值的序列,切除引物錯配和數據中的短序列(一般長度小于150 bp)。按照0.97[23]以上的相似性原則對序列進行歸并并生成應用于物種分類的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)。根據OTU的聚類分析結果與silva數據庫進行對比,得出相對應的物種多樣性信息[24],計算各指數并分析alpha多樣性進而對菌群的多樣性和豐度進行評估[25]。利用UniFrac算法比較樣品間物種的群落差異并進行多樣性分析。

1.3 數據處理

每個指標重復試驗3次。測定結果以平均值加減標準差表示,采用Excel軟件和STATISTIX 8進行數據和制圖分析。顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 各取樣點菌落總數

圖1為各取樣點測得的菌落總數,A、B、C為屠宰分割的不同時期羊胴體表面菌落數,其余為加工過程中各接觸面的取樣。由圖可知,相對于羊胴體,各分割臺面的菌落總數明顯略高,經檢測案板G菌落總數最高可達106CFU/cm2與沖洗過羊胴體的臺面D、分割下的內臟所用的清洗用水H和分割臺面F都有顯著性差異(P<0.05)。而脫毛所用的燙毛水可能因為溫度高其菌數略有下降,僅有104CFU/cm2,并與其他接觸面有顯著性差異(P<0.05)。對于羊胴體表面A、B、C三點來說,開膛后和沖洗后相對于開膛前有顯著性差異(P<0.05),羊胴體經過開膛之后,其菌數顯著性下降(P<0.05),可能是開膛前與開膛后之間經過了一次水洗,而經過C沖洗(水管淋洗)之后,菌數又有略微下降的趨勢,但相對于沖洗之前沒有顯著性差異(P>0.05)。由A、B、C三點可知,在羊胴體進入加工車間之前,開膛、沖洗等操作步驟對菌落數量的影響不大。而結合所有的取樣點來看,當羊胴體進入包裝間后,據測得的菌落數可知在羊肉的分割過程中很有可能造成交叉污染,增加羊肉表面菌群的豐度,可能會對胴體表面的菌群結構產生影響。

圖1 各取樣點菌落總數Fig.1 The number of colonies at each sampling point注:A:開膛前;B:開膛后;C:沖洗后;D:沖洗臺面;E:分割臺面1;F:分割臺面2;G:案板;H:內臟分離水;I:燙毛水;不同小寫字母代表在不同取樣點菌落總數具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 傳統分離法鑒定菌株

將1.2.2中使用選擇性培養基分離得到的43株菌進行測序,所得序列結果用Blast進行對比,并選取同源性最高的菌株序列,鑒定出菌株分別為嗜水氣單胞菌菌株(Aeromonashydrophila)5株,氣單胞菌菌株(Aeromonas)4株,腸桿菌菌株(Enterobacterstrain)7株,變形桿菌菌株(Proteus)2株,葡萄球菌菌株(staphylococcus)6株,大腸桿菌菌株(E.colistrain)4株,梭狀芽胞桿菌菌株(Clostridium)2株,哈夫尼肺泡菌菌株(Hafni’salveolarbacterium)1株,泛菌屬(Pantoea)2株,肌炎沙雷菌(Serratiaserrata)2株,溶酪大球菌菌株(typhimurium)1株,檸檬酸桿菌菌株(Citrobacter)2株,假單胞菌菌株(Pseudomonas)2株,克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)2株,不動桿菌菌株(Acinetobacter)1株。各取樣點分離出的菌落情況如表1。值得一提的是,分割臺面和案板上分離出的菌株種類和數量相對于其他取樣點的培養基更為豐富。傳統分離方法表明,氣單胞菌菌株和腸桿菌菌株的數量在羊肉加工過程中的菌群結構中占據優勢地位。由表1的分離結果根據所選取的同源性最高的菌株系列進行編號,構建系統進化樹如下圖2。

圖2 基于16S rRNA基因構建的43株菌株的進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of 43 spoilagebacteria based on 16S rRNA

表1 不同培養基分離所得菌株的鑒定結果Table 1 The identification results of strainsisolated from different sampling points

2.3 各菌株成膜能力比較

將培養完成的各菌株生物膜按1.2.4所述的方法進行成膜能力計算,其結果如圖3。圖3的每一組柱形圖的寬度表示每一類菌株的數量,柱形圖越寬代表分離得到的菌株數量越多,并在菌群結構中占據優勢;柱形圖的高度則表明分離出的每株菌的成膜能力(B值),B值越大成膜能力越強。由圖3可知,在各類菌株的成膜能力數值中,C類即腸桿菌菌株不僅成膜能力遠遠高于其他菌株,數量上也有一定的優勢,此外嗜水氣單胞菌、葡萄球菌和大腸桿菌的成膜能力和菌株數量也優于剩余的腐敗菌。從這幾種優勢腐敗菌選取的部分結晶紫染色結果來看,腸桿菌(C)和大腸桿菌(F)的染色結果相對于氣單胞菌和葡萄球菌顏色更深,其整體的成膜能力數值也高于其他幾類菌。

圖3 從羊肉加工過程中分離的菌株Fig.3 Strains isolated from the process of mutton dispensing注:A:嗜水氣單胞菌(A1-A5);B:氣單胞菌(B1-B4);C:腸桿菌(C1-C7);D:變形桿菌(D1-D2);E:葡萄球菌(E1-E6);F:大腸桿菌(F1-F4);G:梭狀芽胞桿菌(G1-G2);H:哈夫尼肺泡菌(H1);K:泛菌屬(K1-K2);L:肌炎沙雷菌(L1-L2);M:溶酪大球菌(M1);N:檸檬酸桿菌(N1-N2);P:假單胞菌(P1-P2);Q:克雷伯菌屬(Q1-Q2);R:不動桿菌(R1)。

2.4 高通量測序法測定羊肉加工過程中的菌群結構

2.4.1 測序數據統計與OTU分析 根據Illumina Miseq高通量測序得到羊肉宰殺分割過程中各取樣點總菌數的序列數據,然后經Trimmomatic和FLASH軟件進一步優化得到了15個樣本共1347802條有效序列,主要集中在200～260 bp的區間長度內。當樣品量不斷增大至約40000時,OUT曲線(圖4A)和Shannon曲線趨于平緩(圖4B),樣品中OTU數目不再顯著增加,說明數據量足夠,可以反映樣本中大多數的微生物物種[26]。對羊胴體表面的三個樣品A、B、C測得的OTU進行數據重疊得到羊胴體表面的Venn 圖,然后再對所有取樣點進行數據重疊得到花瓣圖,結果如圖5。從圖5的韋恩圖可知,三個胴體表面樣品之間有相互重疊的部分數據,共有的微生物共有432種,也就是說三個樣品之間有部分相同的菌群結構。同樣地,由花瓣圖可知,所有的取樣點之間也具有相同的菌群結構。

圖4 稀釋曲線(A)和Shannon-Wiener曲線(B)分析Fig.4 Rarefaction curves(A)and Shannon-Wiener curves(B)

圖6 Alpha多樣性指數的箱圖Fig.6 The box plots of Alpha diversity indexes

2.4.2 Alpha多樣性指數分析 Alpha多樣性主要反映待測定樣品的生物多樣性和物種的豐度、均勻度及其測序深度[27]。Alpha多樣性包括四個指標,其中Chao I指數與菌群的豐富度呈正相關,observed_species和PD_whole_tree指數則反映了測序深度,而Shannon指數則關系到群落的多樣性,其數值越大菌群的多樣性越高[24],多樣性結果如圖6。由Chao I指數可知,開膛前的A樣品Chao I指數最高,也就是其菌群豐富度最高,相對來說,經過開膛和沖洗的B、C樣品豐富度大大下降,而剩余的其他樣品豐富度基本跨度不大;相對來說observed_species和PD_whole_tree指數所反映的測序深度與取樣數量密切相關,因此與實際樣品情況存在誤差;由Shannon指數可看出群落多樣性的變化,由圖可知,樣品A的Shannon指數最高,而經過開膛和沖洗的樣品B、C Shannon指數降低,說明開膛和清洗這一步驟使得羊胴體表面菌落多樣性降低。同樣地,對于羊胴體的后續加工過程而言,其沖洗過的臺面D、分割臺面E、內臟分離之后的清洗水H 的Shannon指數也較高,也就是說,羊肉分割的過程中很有可能因為其工具及操作方法而使得羊肉表面的菌落多樣性增加。

2.4.3 物種組成和聚類分析 采用RDP Classifier算法對各樣本序列比對分析,并在科和屬的水平上表達了各取樣點菌群的物種信息,其群落組成如圖7。由圖7可知,開膛前的羊胴體表面菌群多樣性遠遠高于開膛后和沖洗后的羊胴體表面,由圖7-a可知在科水平上A、B、C表面菌群主要有莫拉菌科(Moraxellaceae)、氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、嗜冷桿菌科(Flavobacteriaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)等。而由圖7-b可知在屬水平上A、B、C表面菌群主要有鮑曼不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、類香味菌屬(Myroides)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、死環絲菌屬(Brochothrix)、巨型球菌屬(Macrococcus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、水棲菌屬(Enhydrobacter)等。相對于羊胴體表面,臺面和案板上的菌群多樣性更高,其主要菌種基本上和胴體表面一致,但比例略有不同。此外在科水平上增加了韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、柄桿菌科(Caulobacteraceae)、球菌科(Enterococcaceae)、芽單胞菌科(Xanthomonadaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)等。在屬水平上則增加了羅思氏菌屬(Rothia)、地桿菌屬(Pedobacter)、假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、浮游球衣菌屬(Sphaerotilus)等。

圖7-a 基于科水平的物種組成分析柱狀圖Fig.7-a Histogram of species compositionanalysis based on family level

圖7-b 基于屬水平物種組成分析柱狀圖Fig.7-b Histogram of species compositionanalysis based on genera level

根據科和屬水平上的菌群物種組成及相對豐度,采用UPGMA方法對各取樣點進行聚類分析,結果如圖8。由圖8-a、8-b可知,開膛前的三個取樣點在同一分支,開膛后、沖洗后及所取水樣的幾個分支緊密相關,說明這幾個取樣點的菌群組成和相對豐度類似,而沖洗臺面和案板兩個取樣點菌群組成和其他的取樣點相比差別較大,自成一個分支。

圖8-a 基于科水平的樣本聚類柱狀圖Fig.8-a Sample clustering histogram based on family level

圖8-b 基于屬水平的樣本聚類柱狀圖Fig.8-b Sample clustering histogram based on genera level

2.4.4 不同取樣點菌群結構的主成分分析(principal component analysis,PCA) PCA是應用方差分解,對多維數據進行降解進而將差異反映在二維坐標圖上,顯示出更為簡單明了的規律。如果樣本的菌群結構組成相似,那么在PCA圖上的距離也就越近[28-31]。基于OTU水平的PCA分析結果如圖9。如圖9所示,橫縱坐標分別為PC1與PC2,其貢獻率分別為38.74%和20.6%,說明這兩個主成分是樣品菌群結構組成差異的主要因子。其中在PC1和PC2方向上,A、B、C三個羊胴體表面的取樣點中,B和C較為接近,表明在此主成分水平上開膛后和沖洗后的羊胴體表面菌群特征較為相近,但開膛后B和清洗后C樣品與開膛前的樣品A相比存在較大的差異,說明經開膛這一步驟后,菌群結構發生了較大的變化。沖分割臺面E、F和案板G的菌群特征較接近,與洗臺面D的菌群差異性較大;兩種水樣的菌群結構也存在差異性。

圖9 不同取樣點PCA Fig.9 PCA of different sampling points

3 結論

本研究采用傳統分離方法和Illumina Miseq高通量測序對羊肉加工過程中的各取樣點的菌群結構進行分析。Illumina Miseq高通量測序則研究了羊肉整個加工過程中取樣點的菌群結構,全面地反映了羊肉加工過程的菌群結構變化。研究發現,羊胴體表面和各加工臺面的菌群結構有較大的差異,相對于羊胴體,后續加工的臺面等取樣點菌群的多樣性波動較大,但優勢菌群的種類并沒有多大變化,只是所占比例略有不同。總的來說,羊肉加工過程中的常見的優勢菌群在科水平上主要有莫拉菌科(Moraxellaceae)、氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、嗜冷桿菌科(Flavobacteriaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)等。在屬水平上則包括鮑曼不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、死環絲菌屬(Brochothrix)、羅思氏菌屬(Rothia)、地桿菌屬(Pedobacter)、假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。

傳統培養分離出了可培養菌落,并對篩選出的43株菌株成膜能力進行計算,結果表明嗜水氣單胞菌菌株和腸桿菌菌株數量上有一定優勢,經結晶紫染色并計算其成膜能力可知腸桿菌菌株的成膜能力最強。生物膜的存在使得細菌對環境的耐受性、抗生素的耐藥性大大提高,因此若能抑制生物膜的生長,就能在很大程度上加強殺菌效果,防止細菌性感染等一系列疾病。根據本研究的結果,擬選取數量較多且成膜能力強的菌株進行抑制生物膜的分子機制的進一步研究。