四種稻瘟病生防菌的篩選及其活性評價

楊美華,康冀川2,*,雷幫星2,韓 龍,何 歡

(1.貴州大學生命科學學院,貴州貴陽 550025; 2.貴州大學西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心,貴州貴陽 550025)

水稻是主要的糧食作物之一,全球有半數(shù)的人口以大米為主食[1-3]。由病原菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病則威脅著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì),它是水稻最嚴重的真菌性病害之一,且有著傳播速度快,流行性強,危害嚴重的特點[4-6]。

目前稻瘟病的防治方法主要是依靠化學手段和培育抗病品種[7],化學防治雖見效快,但長期使用化學藥劑會有一定殘留,不僅會危害人畜健康,同時也給環(huán)境安全帶來一定壓力[8],而利用抗病品種也難以達到控制稻瘟病的目的[9]。相比之下,生物農(nóng)藥針對性強、選擇范圍廣,為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保護生態(tài)環(huán)境及保障食品安全提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐[10]。因此,生物防治成為了研究者研究的焦點。生物防治是利用生物的種間關(guān)系,以某種生物去抑制另外一種生物的生長繁殖的方法[11]。目前利用微生物源制劑防治植物病害有良好應用前景,廣泛應用于生產(chǎn)的有真菌、細菌及放線菌[12-13]。其中利用芽孢桿菌防治植物病害的研究較多,芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生芽孢以度過不良環(huán)境,且能產(chǎn)生多種抑制植物病原菌的抗菌物質(zhì),是重要的微生物資源[14]。目前用于稻瘟病防治的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、多黏類芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)等[15-16]。

本研究選取的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14用來防治稻瘟病還未見報道,目前紡錘形賴氨酸芽孢桿菌應用于生物防治的報道較少。本文通過對生防細菌進行拮抗活性的評價及對其發(fā)酵液耐高溫、耐酸堿和抗紫外線等方面進行研究,以期為豐富稻瘟病生防菌資源及開發(fā)生防菌劑打下一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)D1、解淀粉芽孢桿菌hd213、解淀粉芽孢桿菌DEB-2、嗜麥芽寡養(yǎng)假單胞菌(S.maltophilia)he41、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)F2、枯草芽孢桿菌H3、缺陷假單胞菌(Brevundimonasbullata)hd13、紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(L.fusiformis)he14和稻瘟病病原菌(M.oryzae) 貴州大學貴州省生化工程中心分離保藏;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB) 上海博微生物科技有限公司;氫氧化鈉、鹽酸 成都金山化學試劑有限公司。

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;LDZM-60L-IH立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;ZQlY-180N振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Eppendorf高速離心機 Eppendorf公司;JA2003電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 稻瘟病生防菌的篩選 采用平板對峙法測定供試生防菌對稻瘟病的抑制作用[17]。將活化培養(yǎng)的稻瘟病病原菌用直徑為9 mm的打孔器打孔接種于PDA培養(yǎng)基平板中央,然后在其兩側(cè)對稱等距接種經(jīng)NA固體培養(yǎng)基28 ℃活化培養(yǎng)2 d的細菌,以只接種病原菌的平板為空白對照。在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)10～12 d待空白對照長滿平板,觀察抑菌作用,測定病原菌菌落直徑,計算抑菌率,每個處理重復3次。

1.2.2 生防菌發(fā)酵液的制備 將在NA固體培養(yǎng)基上經(jīng)28 ℃培養(yǎng)2 d的細菌單菌落接入NB營養(yǎng)肉湯中,28 ℃、120 r/min恒溫搖床培養(yǎng)24 h即得發(fā)酵種子液,然后以2%的接種量接種于裝有100 mL NB營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中,28 ℃、120 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h,得發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、10000 r/min離心處理10 min,收集上清液,再用0.22 μm無菌過濾器除菌得無菌發(fā)酵濾液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 發(fā)酵液對稻瘟病的抑制作用 采用生長速率法[18],用1×105Pa滅菌30 min后的PDA培養(yǎng)基(冷卻至50 ℃)以體積比配制成分別含細菌發(fā)酵濾液0.5%、1%、2%、4%、8%、16%、32%、64%的不同濃度的培養(yǎng)基,搖勻后倒入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板,以不加發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基作陰性對照,每個處理重復3次。用直徑9 mm的打孔器取已培養(yǎng)12 d的稻瘟病病原菌并接種于平板中央,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d,測量各處理的菌落直徑,計算相對抑菌率,計算方法同1.2.1。

1.2.4 生防菌遺傳穩(wěn)定的測定 將分離鑒定保存至今的細菌活化在NA平板上,在28 ℃恒溫培養(yǎng),待長出菌落后,每24 h轉(zhuǎn)接一次,轉(zhuǎn)接30次,其中選擇第1、5、10、15、20、25、30次的細菌進行測定活性,基于1.2.3的方法選取PDA培養(yǎng)基含細菌發(fā)酵液體積為32%的方法,測定拮抗細菌對稻瘟病的拮抗活性,處理方法與1.2.3相同,測量菌落直徑,計算抑菌率,方法同1.2.1。

1.2.5 發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性 將分離鑒定保存至今的細菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制備好細菌發(fā)酵液并用0.22 μm的無菌過濾器過濾得無菌發(fā)酵濾液,將無菌發(fā)酵濾液分別置于40、60、80、100、121 ℃下處理30 min,冷卻至室溫后與PDA混合[19],其余操作方法同1.2.3。記錄結(jié)果,測量稻瘟病菌菌落直徑,計算抑菌率,方法同1.2.1。

1.2.6 發(fā)酵液的抗紫外線穩(wěn)定性 將分離鑒定保存至今的細菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制備好細菌發(fā)酵液并用0.22 μm的無菌過濾器過濾得無菌發(fā)酵濾液,將制備好的細菌發(fā)酵濾液放在超凈臺上,液面高度調(diào)整為0.5 cm,分別照射無菌發(fā)酵液15、30、60、180、360 min后取出,經(jīng)紫外線照射處理后的發(fā)酵液再經(jīng)無菌過濾器過濾,以未經(jīng)紫外線處理的發(fā)酵液作為對照抑菌活性效果。其余操作方法同1.2.3。記錄結(jié)果,計算抑菌率,方法同1.2.1[20]。

1.2.7 發(fā)酵液的耐酸堿性 將分離鑒定保存至今的細菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制備好細菌發(fā)酵液并用0.22 μm的無菌過濾器過濾得無菌發(fā)酵濾液,用5 mol/L氫氧化鈉、36%的鹽酸將發(fā)酵濾液的pH分別調(diào)為3、5、7、9、11,然后在室溫下靜置30 min,再將pH調(diào)為7,為防止污染,將經(jīng)過處理的發(fā)酵濾液再經(jīng)0.22 μm的無菌過濾器過濾,其余操作方法與1.2.3相同。觀察并記錄結(jié)果,計算抑菌率,方法同1.2.1[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,采用單因素方差進行組間比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病生防菌的篩選

通過平板對峙實驗,可以直觀看到生防菌對稻瘟病菌的抑制效果,如圖1所示。從8株供試菌株中篩出對稻瘟病菌有一定拮抗作用的菌株5株,在這5種菌中有4種有良好拮抗效果,其對稻瘟病菌的抑制程度見表1。通過計算,菌株D1、he41、he14及H3對稻瘟病引起的生長抑制均大于61%,F2次之,抑制率為59.30%,其余3株均無明顯抑制作用,原因主要是:生防細菌能產(chǎn)生抗菌物質(zhì),抑制病原菌生長,但各生防細菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)存在差異,因此抗菌效果也不同[22]。

表1 不同拮抗細菌對稻瘟病菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effects of differentantagonistic bacteria on Magnaporthe oryzae

圖1 平板上抗真菌活性測定Fig.1 Antifungal activity assays on Petri plates注:a:空白對照;b:解淀粉芽孢桿菌D1;c:嗜麥芽寡養(yǎng)假單胞菌he41;d:枯草芽孢桿菌H3;e:紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14;f:枯草芽孢桿菌F2;g:解淀粉芽孢桿菌DEB-2;h:缺陷假單胞菌hd13;i:解淀粉芽孢桿hd213。

2.2 生防菌發(fā)酵液對稻瘟病菌的抑制作用

表2結(jié)果表明,稻瘟病菌在含無菌發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基上生長時被不同程度抑制,其菌絲生長抑制水平與無菌發(fā)酵濾液濃度呈正相關(guān);當采用含0.5%發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病菌時,稻瘟病菌菌絲依然能被輕微抑制,抑制效果在13.19%～25.02%之間;當發(fā)酵液所占的比例達到32%時,菌株D1、he41、he14、H3的無菌發(fā)酵濾液對稻瘟病菌的菌絲抑制率均達90%以上,抑菌效果明顯;當發(fā)酵液所占的比例達到64%時,D1、he14、H3、he41的無菌發(fā)酵濾液能讓稻瘟病菌的菌絲均不能生長,即抑制率達100%。這與蔡長平等[23]報道的放線菌CZ113的無菌發(fā)酵液對稻瘟病的抑制效果果相似。

2.3 生防菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后對稻瘟病菌菌絲的抑菌效果

菌株D1、H3、he41、he14繼代培養(yǎng)30次,其中第1、5、10、15、20、25、30次的抑菌活性變化情況如圖2所示,各次數(shù)之間的抑菌率沒有顯著差異,且所有的生防菌對稻瘟病菌菌絲的抑菌率都在86%～100%之間,表現(xiàn)了良好的遺傳穩(wěn)定性,因此菌株D1、he14、he41、H3不易發(fā)生遺傳變異,能夠穩(wěn)定遺傳。相關(guān)研究結(jié)果多有報道生防細菌在多次繼代培養(yǎng)后依然能保持其抑菌效果。如張聰穎等[24]篩選到的枯草芽孢桿菌HT-6經(jīng)連續(xù)傳代10次后,對致病疫霉的抑菌率保持在80%以上。鄒秋霞等[25]報道的枯草芽孢桿菌YN145繼代培養(yǎng)25代后,對稻瘟病菌的抑制率保持在80%以上。綜上所述本文獲得的菌株D1、he14、he41、H3對稻瘟病菌的抑制作用與轉(zhuǎn)接次數(shù)不呈相關(guān)性,有良好應用前景。

2.4 生防菌發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

生防菌無菌發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度處理后的結(jié)果如圖3所示。圖4直觀地展示了菌株he14的無菌發(fā)酵濾液在不同溫度處理后對稻瘟病的抑制效果。菌株D1、he41、H3的無菌發(fā)酵濾液在上述的溫度下處理后對稻瘟病菌菌絲均無抑菌作用,表現(xiàn)了極差的熱穩(wěn)定性,說明它們所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在加熱的條件下容易變性失活。由圖3和圖4可知,而菌株he14的發(fā)酵液在40、60、80、100 ℃的溫度條件下處理后,對稻瘟病菌菌絲的抑菌率仍保持在90%以上,在121 ℃處理30 min后,抑菌率下降到82%,但也表現(xiàn)了良好的熱穩(wěn)定性;菌株he14所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)大概分為兩部分,即大部分為耐高溫,少部分為對溫度敏感,易變性失活。據(jù)相關(guān)文獻報道,抗菌物質(zhì)經(jīng)100、120 ℃處理后保持其良好抗菌活性的生防細菌較少,如多粘類芽孢桿菌F17的無菌發(fā)酵液經(jīng)高溫處理后散失抗菌活性,短小芽孢桿菌F1和枯草芽孢桿菌H1的無菌發(fā)酵液對溫度有良好的耐受性,經(jīng)高溫處理有明顯抗菌作用[26]。解淀粉芽孢桿菌Y5-18發(fā)酵液中的活性物質(zhì)經(jīng)100 ℃處理30 min后的抑菌率為60%[27]。與這些菌株相比,菌株he14的抗菌活性物質(zhì)對溫度有更好的耐受力。

圖3 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14菌株發(fā)酵濾液在不同溫度處理30 min后對稻瘟病菌生長的拮抗作用Fig.3 Antagonistic effect of the fermentation supernatantfiltrate of Lysinibacillus fusiformis he14 under differenttemperatures for 30 min on mycelium growth of M.oryzae

圖4 不同溫度對紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14菌株發(fā)酵液抑制稻瘟病菌的影響Fig.4 Different temperature effect the fermentation supernatantfiltrate of Lysinibacillus fusiformis he14 inhibiting the growth ofM. oryzae temperatures for 30 min on mycelium growth of M. oryzae注:a:空白對照;b:40 ℃;c:60 ℃;d:80 ℃;e:100 ℃;f:121 ℃。

2.5 生防菌發(fā)酵液的抗紫外線穩(wěn)定性

四株拮抗菌的發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射不同時間后的結(jié)果如圖5,結(jié)果表明,菌株D1、he41、H3、he14的發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射15、30、60、180、360 min對稻瘟病菌菌絲的抑菌率仍保持在83%～95%之間,抑菌率與照射時間不呈相關(guān)性,表現(xiàn)良好的抗紫外線穩(wěn)定性;其中菌株D1的抑菌率都為95%,效果最好;菌株he14、H3、he41的抑菌率稍次于菌株D1,但抑菌率仍在83%以上。相關(guān)研究結(jié)果多有報道生防細菌的抗菌物質(zhì)經(jīng)長時間紫外照射仍能保持良好的抑菌效果,解淀粉芽孢桿菌CWJ2經(jīng)紫外線處理30 min后的抑菌效果略有上升[28]。變綠色粘球菌YR-35的無菌發(fā)酵液經(jīng)30 W的紫外燈處理后,對馬鈴薯晚疫病的抑菌率保持不變[29]。本文的研究結(jié)果與已報道的研究結(jié)果相似。

圖5 菌株D1、he41、H3、he14發(fā)酵濾液在紫外線下照射不同時間后對稻瘟病菌生長的拮抗作用Fig.5 Antagonistic effect of fermentation filtrates ofstrains D1,he41,H3 and he14 on the growth ofM. oryzae after ultraviolet light irradiation for different time

2.6 生防菌發(fā)酵液的耐酸堿性

不同pH條件下菌株D1、he41、he14、H3的無菌發(fā)酵濾液對稻瘟病菌的抑菌活性變化情況如圖6。結(jié)果顯示,在pH在3～11之間變化時,菌株D1、H3、he41的無菌發(fā)酵濾液對稻瘟病菌菌絲的抑菌率保持在90%以上,抑菌率無明顯變化;菌株he14的無菌發(fā)酵濾液在pH11.0的偏堿環(huán)境時,抑菌活力下降到82.12%。相關(guān)研究結(jié)果顯示,在偏酸和偏堿環(huán)境下生防菌抗菌物質(zhì)的抗菌效果弱于中性環(huán)境[30]。菌株SR13-2、WL2、YQ5的發(fā)酵液在pH2.0～12.0內(nèi)保持穩(wěn)定,但在pH為2.0、12.0時對致病疫霉的抑菌率明顯低于中性環(huán)境[31-33]。與報道的菌株相比,此研究的菌株D1、he41、H3、he14更具優(yōu)勢,pH在3～11內(nèi)保持穩(wěn)定,具有潛在的研究意義。

圖6 菌株D1、he41、H3、he14發(fā)酵濾液在不同pH處理30 min后對稻瘟病菌生長的拮抗作用Fig.6 Antagonistic effect of the fermentation supernatantfiltrate of D1,he41,H3 and he14 under different pHfor 30 min on mycelium growth of M. oryzae

3 討論

近年來,篩選出高抑菌效果的生防菌株抑制稻瘟病菌、防治稻瘟病已成為水稻病害防治中的研究熱點。Meng等[34]研制的枯草芽孢桿菌T249粉劑,對稻瘟病的田間防治效果為77.6%～78.5%。Saikia等[35]分離的側(cè)孢短芽胞桿菌BPM3的發(fā)酵濾液對稻瘟病的防治效果為30.0%～67.0%,可減少35.05%～56.5%的產(chǎn)量損失。Suryadi等[36]篩選的堅強芽胞桿菌E65的發(fā)酵液對稻瘟病菌的抑菌率為73%～85%。沙月霞等[37]分離的解淀粉芽孢桿菌S170對稻瘟病的溫室防治效果達80.57%。

目前,對生防芽孢桿菌的研究已深入到了許多方面,芽孢桿菌能夠產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)和抗菌蛋白等,對多種植物病原菌具有高效抑制作用[38]。Arima等[39]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性素具有抗病毒、抗支原體和抗細菌活性。Cho等[40]發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌KS03的主要抗菌化合物是伊枯草菌素A2。高娃等[41]的研究表明,解淀粉芽孢桿菌TF28抗菌蛋白Tas A基因的表達產(chǎn)物可以高效抑制黃瓜灰霉病。Yoshid等[42]報道從解淀粉芽孢桿菌RC22分離的抗菌蛋白對桑樹病原菌有良好抑制作用。本研究中的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14經(jīng)30次繼代培養(yǎng),其無菌發(fā)酵濾液可耐受121 ℃高溫(30 min)、紫外線照射6 h、pH3～11,抑菌率保持穩(wěn)定,本研究同時還選取了稻瘟病菌另外兩個生理小種也進行了試驗,紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14對其抑菌率也均達82%以上,且紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14用來防治稻瘟病還未見報道,具備了良好的研究價值。

4 結(jié)論

本研究的菌株D1、he41、H3、he14能穩(wěn)定遺傳,其代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌有良好的抑制效果,且其抗菌物質(zhì)有明顯的耐酸堿穩(wěn)定性、抗紫外線穩(wěn)定性,菌株he14的抗菌物質(zhì)具有明顯的熱穩(wěn)定性,121 ℃下處理30 min仍能保持82%的抑菌活性,與報道的相比更好。利用這些特性菌株he14可作為生防菌劑開發(fā)的潛能。本研究將會進一步菌株D1、he41、H3、he14對稻瘟病的生防效果、抗菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)和抑菌機理,為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應用做好基礎(chǔ)。