海洋鏈霉菌Streptomyces sp.MCCC 1A09830抗菌成分的分離與鑒定

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(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095; 2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室,福建廈門 361005)

天然產(chǎn)物是小分子藥物的重要來源,為人類提供了大量的合成藥物、半合成藥物,以及合成藥物所需的骨架[1]。微生物來源的天然產(chǎn)物是天然產(chǎn)物研究的重要組成部分。據(jù)統(tǒng)計,在已有的500000種天然產(chǎn)物中,大約有70000種天然產(chǎn)物是由微生物提供的[2]。微生物來源的天然產(chǎn)物因為具有多樣的生物活性,而在醫(yī)藥行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用,如抗生素、免疫抑制劑、抗糖尿病藥、抗癌藥物等[3]。

海洋占地球面積的70%,擁有著地球97%的水資源、87%的生物資源,因此成為了新型微生物的重要來源,為人類提供了豐富的天然產(chǎn)物[4-6],也為藥物開發(fā)提供了珍貴的先導化合物資源[7]。海洋微生物及其代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為新世紀藥物開發(fā)的熱點[8-9],其中海洋鏈霉菌因其突出的生物合成潛力,而在天然產(chǎn)物研究中占據(jù)著重要的地位,其代謝產(chǎn)物具有多樣的生物活性,如抗菌、抗氧化、抗病毒、抑制血管生成等[10]。研究者們已經(jīng)從海洋鏈霉菌中得到了許多新型的天然產(chǎn)物。Khalil等[11]從海洋鏈霉菌Streptomycessp. CMBM0150的發(fā)酵產(chǎn)物中得到了aranciamycins I和aranciamycins J。Chen等[12]從海洋鏈霉菌Streptomycessp. OUCMDZ-3434的產(chǎn)物中分離得到Wailupemycin類化合物。王聰?shù)萚13]從廣西北部灣的泥樣中分離到了Streptomycessp. MDCW-126,并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到形孢菌素,這是一種具有抑菌活性的吲哚咔唑類化合物。

張玉便等[14]從取自南大西洋深海沉積物的3個樣品中分離得到了132株放線菌,對部分菌株進行了活性檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析,沒有進行產(chǎn)物分離與結(jié)構(gòu)鑒定。本文為了充實、豐富文章內(nèi)容,進一步研究發(fā)酵菌種,以其16S rRNA基因序列為基礎(chǔ),構(gòu)建進化樹,確定菌種與已知菌種的親緣關(guān)系,并對Streptomycessp. MCCC 1A09830發(fā)酵產(chǎn)物中的活性產(chǎn)物進行分離、鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Streptomycessp. MCCC 1A06678(H2)、Streptomycessp. MCCC 1A09830(H3)、Streptomycessp. MCCC 1A09831(H4)、Streptomycessp. MCCC 1A09832(H5)、Streptomycessp. MCCC 1A09835(H7)、Streptomycessp. MCCC 1A09966(H9)和Streptomycessp. MCCC 1A10313(H10) 中國海洋微生物菌種保藏管理中心;以上菌株的16S rRNA基因序列 由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供;Bacillussubtilis,EscherichiacoliATCC 25933、StaphylococcusaureusRN4220和SaccharoraycescerevisiaeCRY1-2(用作活性檢測的酵母菌) 由本課題組保藏;酵母粉、氯化鈉、胰蛋白胨、酵母提取物 生工生物工程(上海)股份有限公司;瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司;HP-20樹脂 上海捷瑞生物工程有限公司;柱層析硅膠(200～300目) 青島海洋化工廠分廠;Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、氯化鈉10.0、瓊脂粉15.0、pH7.0;Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、氯化鈉10.0、pH7.0;MS 液體培養(yǎng)基(g/L):D-甘露醇20.0、大豆粉20.0、pH7.0;MS 固體培養(yǎng)基(g/L):D-甘露醇20.0、大豆粉20.0、瓊脂粉20.0、pH7.0;Yeast Extract Peptone Dextrose(YPD)酵母培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物10.0、蛋白胨20.0、葡萄糖20.0、瓊脂粉20.0、pH7.0。

CT15RT高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司;IMS-70全自動雪花制冰機 常熟市雪科電器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;CTO-10ASVP島津高效液相色譜儀 島津中國;WUF-400型-80 ℃超低溫冰箱 DAHAN科學儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;37 ℃培養(yǎng)箱、37 ℃烘箱 余姚市金宏儀器廠;EYEL型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 進化樹構(gòu)建方法 將海洋菌株的16S rDNA序列上傳到NCBI網(wǎng)站進行比對,用MEGA 5.0的Clustal W Mutiple alignment對結(jié)果中同源性高的序列和海洋菌序列進行多序列比對,將兩端的空位刪除,保存;保存的文件用MEGA打開,從phylogeny中選擇Neighbor-jionig Tree構(gòu)建發(fā)育進化樹,進一步確定Streptomycessp. MCCC 1A09830與已知菌種的親緣關(guān)系。

1.2.2 抗菌活性物質(zhì)粗物的制備

1.2.2.1 孢子的培養(yǎng) 選擇MS固體培養(yǎng)基用于孢子的培養(yǎng);使用滅菌棉棒蘸取孢子液并在MS平板上劃線,30 ℃培養(yǎng)2～4 d;挑取生長良好的單個孢子,劃滿整個MS平板,30 ℃培養(yǎng)7 d左右。

1.2.2.2 孢子的收集 對生長狀態(tài)良好的孢子進行收集,使用無菌棉簽蘸取滅菌水,將平板上的孢子收集到50 mL的離心管中;使用塞有脫脂棉的無菌槍頭將離心管中的孢子過濾到新的50 mL離心管中,去除孢子中的培養(yǎng)基成分,配平后離心,4000 r/min,10 min,棄上清;加入滅菌水沖洗,配平后離心,4000 r/min,10 min,棄上清;取20%甘油清洗孢子,配平后離心,4000 r/min,10 min,棄上清;加入20%甘油,配平后離心,4000 r/min,10 min,棄上清;取10%甘油重懸,將孢子分裝在小管中,在-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2.3 發(fā)酵與粗物提取 使用不同的培養(yǎng)基對Streptomycessp. MCCC 1A09830進行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物的活性最高,因此選擇MS培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基(含樹脂)。將樹脂浸泡在100%乙醇中,過夜后去掉乙醇,清水洗凈,備用;配制MS液體培養(yǎng)基,稱取適量大豆粉,加入定量的去離子水,煮沸2 h后用雙層紗布過濾至三角瓶中,加入定量的D-甘露醇并攪拌均勻,定容后分裝在250 mL三角瓶中,每個三角瓶加入50 mL的培養(yǎng)基,使用紗布、報紙封口,高壓滅菌處理;吸取50 μL孢子液,按照1‰的比例接種于250 mL三角瓶的MS培養(yǎng)基中,在28 ℃,225 r/min的搖床條件下培養(yǎng)3～5 d;取4 mL無污染、顏色正常的種子液轉(zhuǎn)接于400 mL含有大孔吸附樹脂(5%)的MS液體培養(yǎng)基中,在28 ℃,225 r/min的搖床條件下培養(yǎng)10 d。發(fā)酵結(jié)束后,將MS發(fā)酵培養(yǎng)基從搖床中取出,清水沖洗發(fā)酵液數(shù)次至只剩下樹脂,樹脂通過漏斗過濾后,在室溫條件下晾干;將樹脂浸泡于100%甲醇中,4 h,浸泡過的甲醇轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮,溫度設(shè)置為35 ℃;重復浸泡樹脂,濃縮至干,溶于甲醇的物質(zhì)即為抗菌活性物質(zhì)粗物。

1.2.2.4 粗物檢測 取10 μL抗菌活性物質(zhì)粗物,經(jīng)甲醇稀釋至300 μL,使用新注射器吸取粗物稀釋液,通過有機相針頭過濾器過濾后,置于液相小瓶中待測;對樣品進行高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析,進樣量是10 μL;HPLC分析條件:Diamonsil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱,檢測器為SPD-M20A,柱溫箱溫度為25 ℃,流速為1 mL/min,檢測波長為254 nm;分析方法為甲醇/ddH2O(20∶80～100∶0,線性梯度洗脫,50 min)。

1.2.3 抗菌活性物質(zhì)的分離純化 本實驗的分離純化方法是硅膠柱層析,采用干法上樣,干法裝柱。

1.2.3.1 拌樣 拌樣是硅膠柱層析的重要步驟,硅膠用量與拌樣的均勻程度是影響分離效果的重要因素[19]。具體步驟如下:稱取定量的硅膠粉(200～300 目,樣品質(zhì)量∶硅膠量=1∶3)置于陶瓷研缽;一邊將抗菌活性物質(zhì)粗物緩慢的加入硅膠,一邊用藥匙研磨硅膠,待硅膠中的甲醇揮發(fā)、硅膠顆粒分散均勻后,停止拌樣,所得硅膠粉為上柱樣品。

1.2.3.2 裝柱 裝柱是影響樣品分離效果的關(guān)鍵一步,要將硅膠壓實,以免樣品條帶發(fā)生彌散,導致純化效果不理想。具體步驟如下:清洗層析柱,甲醇潤洗、晾干;取定量硅膠(200～300 目,質(zhì)量是樣品量的20倍)緩慢裝入層析柱,使用真空泵抽真空并輕敲柱身,使硅膠填充均勻,當硅膠界面不在下降時,停止抽真空,保持硅膠界面水平;將樣品緩慢加入玻璃柱中,保證樣品均勻分布在柱子表面,并在樣品表面覆蓋一層硅膠,以防加洗脫液時樣品飛濺;在樣品上方塞入小團棉花,沿柱子邊緣加入洗脫液,使用三角瓶收集組分。

1.2.3.3 洗脫 配制洗脫液,采用梯度洗脫,梯度洗脫是指選擇不同極性的溶劑、按照不同的比例對樣品進行洗脫。本次實驗選取二氯甲烷、甲醇作為洗脫劑。梯度順序如下,100%的二氯甲烷,二氯甲烷∶甲醇=100∶1,二氯甲烷∶甲醇=100∶2,二氯甲烷∶甲醇=100∶3,二氯甲烷∶甲醇=100∶5,二氯甲烷∶甲醇=100∶10。對洗脫的溶液進行分組、蒸干,加入甲醇溶解。濃縮合并有活性的樣品后,進行第二次硅膠柱層析分離。第二次分離選擇石油醚、二氯甲烷、甲醇作為洗脫劑,梯度順序如下,石油醚∶二氯甲烷=5∶1,100%的二氯甲烷,二氯甲烷∶甲醇=100∶1,二氯甲烷∶甲醇=100∶1.5,二氯甲烷∶甲醇=100∶2,二氯甲烷∶甲醇=100∶3,二氯甲烷∶甲醇=100∶4,二氯甲烷∶甲醇=100∶5,二氯甲烷∶甲醇=100∶8,二氯甲烷∶甲醇=100∶10。濃縮樣品并使用HPLC對活性樣品進行分析,檢驗純化效果。

1.2.4 抗菌活性物質(zhì)的制備 樣品預(yù)處理:使用新注射器吸取1.2.3.3中制備的活性樣品,通過有機相針頭過濾器進行過濾,置于液相小瓶中,備用。使用HPLC對活性樣品進行制備,色譜條件為:YMC-Pack ODS-A(5 μm,10.0 mm×250 mm)色譜柱,柱溫箱溫度25 ℃,流速為4 mL/min。制備方法為:甲醇/ddH2O(70∶30～80∶20,線性梯度洗脫,30 min)。將制備好的樣品進行旋蒸至干燥,使用色譜級甲醇溶解樣品,低溫保存。對制備好的樣品進行HPLC檢測,檢驗制備效果,檢測條件:Diamonsil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱,柱溫箱溫度為25 ℃,流速為1 mL/min,檢測波長為254 nm。分析方法為:甲醇/ddH2O(20∶80～100∶0,線性梯度洗脫,50 min)。

1.2.5 抑菌活性檢測與結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.5.1 抑菌活性檢測 將過夜培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌ATCC 25933、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母CRY1-2,按照體積分數(shù)1%的比例分別加入未凝固的固體LB培養(yǎng)基中,搖勻并倒入平板,使培養(yǎng)基凝固;使用打孔器將普通濾紙制成直徑為0.5 cm的紙片,濾紙片經(jīng)烘干后備用;取20 μL抗菌活性物質(zhì)的稀釋液,濃度為20 mg/mL,滴加在濾紙片上,使其充分吸收產(chǎn)物;待濾紙片晾干后,分別放置在平板表面,輕輕按壓,使紙片完全接觸培養(yǎng)基,前三種指示菌37 ℃、釀酒酵母CRY1-2 30 ℃,培養(yǎng)過夜,觀察抑菌圈大小,抑菌圈的大小表示抑菌活性的強弱。

1.2.5.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1經(jīng)色譜級甲醇溶解,通過有機相針頭過濾器過濾后,轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜樣品瓶中,備用;對樣品進行HR-ESI-MS檢測以獲得活性物質(zhì)的分子量,推定化合物分子式。樣品經(jīng)氘代甲醇溶解后,轉(zhuǎn)移至核磁管中,進行核磁共振分析,得到核磁共振數(shù)據(jù),將核磁數(shù)據(jù)與文獻數(shù)據(jù)比較,確定了化合物的結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均有三個平行,核磁數(shù)據(jù)、進化樹數(shù)據(jù)、液相數(shù)據(jù)的處理均采用word2007,核磁圖譜采用MestReNova處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 進化發(fā)育樹的構(gòu)建

使用MEGA 7.0,以海洋菌的16S rRNA基因序列和比對結(jié)果序列為基礎(chǔ),構(gòu)建進化樹,研究Streptomycessp. MCCC 1A09830與其它菌種的親緣關(guān)系(如圖1)。建樹方法采用鄰接法(neighbor-joining,NJ),通過bootstrap檢測置信度。Streptomycessp. MCCC 1A09830與Streptomycessp. NEAE-126同源,相似度為99.85%,且自展值達到了98%。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的7株海洋鏈霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 7 marine Streptomyces based on the 16S rRNA gene sequences

2.2 抗菌活性物質(zhì)粗物的制備

由圖2可知,活性物質(zhì)粗物的樣品主要有8種組分,保留時間集中在30～46 min之間,其中強度最高的有3個峰,保留時間分別在31.5、34.5、43.0 min左右。根據(jù)液相結(jié)果,需要對發(fā)酵粗提物進行下一步的硅膠柱層析分離。

圖2 抗菌活性物質(zhì)粗物的液相色譜分析Fig.2 HPLC analysis of fermentation broth ofStreptomyces sp. MCCC 1A09830

2.3 抗菌活性物質(zhì)的分離純化

發(fā)酵粗提物經(jīng)過硅膠柱層析得到了初步分離產(chǎn)物,活性產(chǎn)物主要在2個梯度(甲醇∶二氯甲烷=100∶3,甲醇∶二氯甲烷=100∶5)的洗脫收集液中。由圖3可知,該樣品主要有4個組分,活性產(chǎn)物的保留時間在40.0 min左右。與圖2比較,圖3樣品中的組分種類相對較少,說明經(jīng)過硅膠層析處理后,樣品的雜質(zhì)更少,這更有利于產(chǎn)物的純化與活性組分的判斷。整體上,發(fā)酵粗提物在硅膠柱上的純化效果很好,達到了純化的目的。

圖3 硅膠層析后活性組分的液相色譜分析Fig.3 HPLC analysis of purified active compoundafter silica gel column chromatography

2.4 抗菌活性物質(zhì)的制備

通過產(chǎn)物粗提、硅膠柱層析分離、高效液相色譜的分析與制備等多個步驟,實現(xiàn)了對Streptomycessp. MCCC 1A09830發(fā)酵產(chǎn)物的純化,最終得到化合物1。由圖4可知,該化合物的保留時間為39.5 min,化合物呈單峰,峰形較為對稱,這說明樣品中的雜質(zhì)很少,HPLC的純化效果滿足檢測要求,這為下一步的核磁共振檢測打下了基礎(chǔ)。本次發(fā)酵試驗,發(fā)酵液的總體積為14.4 L,共獲得15 mg化合物。

圖4 化合物1的液相色譜分析Fig.4 HPLC analysis of compound 1

2.5 活性檢測與結(jié)構(gòu)鑒定

2.5.1 活性檢測 本研究對化合物1進行了抑菌試驗,選取了枯草芽孢桿菌、大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌和釀酒酵母CRY1-2作為指示菌。試驗結(jié)果如圖5,化合物1針對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌ATCC25933、金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌圈直徑分別為:2.4、1.5、1.2、1.2 cm。試驗結(jié)果表明,化合物1對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最高,且對細菌、酵母菌都有抑制活性,且抑制能力是不同的。張玉便等[14]對Streptomycessp. MCCC 1A09830的粗提物進行了活性檢測,發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵粗提物對枯草芽孢桿菌具有活性,抑菌圈大小為9 mm。

圖5 化合物1的抑菌實驗Fig.5 Antibacterial assay of compound 1

2.5.2 結(jié)構(gòu)鑒定 在本研究中,化合物1的結(jié)構(gòu)是通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、一維核磁共振(1D NMR)及二維核磁共振(2D NMR)確定的,質(zhì)譜采用的是HR-ESI-MS。高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示m/z 512.2983為[M+Na]+,m/z與理論計算值 m/z 512.2983相同(圖6),說明該化合物分子式為 C28H43NO6,計算分子量為489.3085。通過scifinder 按分子式搜索,得知該化合物與Borrelidin類化合物[15]結(jié)構(gòu)相似度較高。用 COSY、HSQC、HMBC和C13NMR 歸屬了碳化學位移及氫化學位移(表1),通過碳化學位移比較發(fā)現(xiàn)該化合物可能是Borrelidin A或B(δC13=145.6,δC-14=129.0)。再通過氫化學位移比較,發(fā)現(xiàn)該化合物與Borrelidin A數(shù)據(jù)吻合(δH-13=6.9,d;δC-14=6.6,dd)。其它位置化學位移均與Borrelidin A數(shù)據(jù)吻合,所以該化合物結(jié)構(gòu)被確定為Borrelidin A(圖7)。Borrelidin A的氫譜和碳譜如圖8～圖9。Borrelidin A,又稱為疏螺旋體素、勃利霉素,是一種帶有腈官能團的大環(huán)內(nèi)酯。外觀是一種白色無定形粉末。關(guān)于Borrelidin A的合成基因簇已有報道[16-18]。

表1 化合物1碳譜與氫譜化學位移Table 1 Chemical shift of carbon spectrum and hydrogen spectrum of compound 1

圖6 化合物1的高分辨質(zhì)譜Fig.6 High resolution mass spectrometry of the compound 1

圖7 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structure of compound 1

圖8 化合物1的1H NMR譜(500 MHz)Fig.8 1H NMR(500 MHz)spectrum of compound 1

圖9 化合物1的13C NMR譜(125 MHz)Fig.9 13C NMR(125 MHz)spectrum of compound 1

3 結(jié)論與討論

本研究通過對7株海洋鏈霉菌的16S rRNA基因序列的分析,探究了海洋鏈霉菌Streptomycessp. MCCC 1A09830與其它菌種的親緣關(guān)系;同時以海洋鏈霉菌Streptomycessp. MCCC 1A09830為研究對象,通過液體發(fā)酵的方式富集菌株的次級代謝產(chǎn)物,經(jīng)過產(chǎn)物粗提、硅膠柱層析、高效液相色譜等技術(shù)手段,對Streptomycessp. MCCC 1A09830的活性組分進行了分離純化,最終得到化合物1。進化分析結(jié)果顯示Streptomycessp. MCCC 1A09830與Streptomycessp. NEAE-126同源,且自展值達到了98%;化合物1的活性檢測結(jié)果顯示其對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌ATCC25933、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母CRY1-2具有抑制作用。通過高分辨質(zhì)譜、核磁共振等手段獲得ESI-MS質(zhì)譜、1H NMR氫譜圖、13C NMR碳譜圖,確定了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。最終確認化合物1與文獻報道[19]中的Borrelidin為同一種化合物。疏螺旋體素最早發(fā)現(xiàn)于婁徹氏鏈霉菌(Streptomycete.rochei)的發(fā)酵產(chǎn)物中[19-20],具有抗細菌、真菌[21-22]、病毒[23]、瘧原蟲[24-27]的生物活性。疏螺旋體素不僅可以抑制新血管的形成和人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖,還能誘導毛細血管細管細胞凋亡[28-29],這對癌癥的治療有一定的幫助[30]。除了Borrelidins A,研究者們進一步還發(fā)現(xiàn)了Borrelidins B[16]、Borrelidins C-I等一系列疏螺旋體素類似物[31],這些研究表明疏螺旋體素具有很高的研究價值。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵粗提物中還含有其它的微量組分,需要進一步的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。這項工作不僅豐富了Borrelidin的生產(chǎn)菌庫,為海洋菌株活性產(chǎn)物的分離提供了支持,也表明了海洋微生物在天然活性小分子的方向具有一定的發(fā)展?jié)摿?可以為天然藥物開發(fā)提供寶貴的研究資源。