谷氨酸鈉和抗壞血酸協同處理藜麥萌發富集γ氨基丁酸工藝優化及膽酸鹽吸附能力研究

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(1.青海大學農林科學院,青海省青藏高原農產品加工重點實驗室,青海西寧 810016; 2.省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室,青海西寧 810016)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是一種原產于印第安地區的藜科藜屬一年生雙子葉假谷物,是印第安土著居民的主要食物之一[1]。藜麥有“糧食之母”、“營養黃金”等美稱,距今已有5000～7000年的種植歷史,目前在我國陜西、甘肅、山西、青海、四川、浙江、吉林等地區均有種植[2]。藜麥營養與活性成分包括淀粉、蛋白質、多糖、膳食纖維、脂肪、多酚、皂苷、礦物質(Mn、Fe、Mg、Ca等)、維生素(VB1、VB2、VC)等,其中蛋白質含量可達16.5%,氨基酸組成比例均衡,含有8種人體必需氨基酸,尤其賴氨酸(5.1%～6.4%)和蛋氨酸(0.4%～1.0%)含量明顯高于一般谷物,具有極高的食用價值[3-4]。藜麥中富含的多酚、黃酮、不飽和脂肪酸、皂苷等植物活性成分表現出良好的抗氧化、抗腫瘤、抗菌、降血脂、降血壓、降血糖等功效,使得藜麥成為健康功能食品開發的研究熱點[5-7]。

萌發是高等植物生命活動中一個物質分解與合成代謝活躍的時期,在該過程中存在多種生理變化和形態變化[8]。萌發處理能改善種子的氨基酸含量與組成、提高蛋白質的消化特性和利用率、增加游離糖和酚類化合物含量、提高B族維生素含量、降低抗營養因子水平及改善食品的加工特性和感官品質[9-11]。谷物種子經過萌發后還可形成或富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等活性成分,其對提高食品功能品質具有重要作用。四碳非蛋白氨基酸GABA作為種子萌發中關鍵活性物質之一,具有降血壓、緩解疼痛、改善腦機能和抗焦慮等功效[12],而萌發谷物降血脂作用也可能與存在γ-氨基丁酸相關[13]。功效組分可通過吸附膽酸鹽并將其排出體外來降低膽酸鹽在腸循環中的積累,促進膽固醇代謝、降低血脂,從而改善機體健康[14]。

目前,雜糧及大宗谷物如糙米、紅米、燕麥、青稞、藜麥、綠豆、玉米等的萌發及GABA富集已引起了研究人員的較多關注[9,11-13,15-17];其中有關藜麥萌發的研究相對較少,已有報道主要對藜麥萌發期營養與功能成分變化、GABA的富集及藜麥芽食品開發做了初步探討[8,12,18-19]。研究表明,逆境脅迫(鹽脅迫、酸脅迫、受熱、受冷、低氧脅迫、CO2處理、金屬離子處理等)可以激活谷氨酸脫羧酶(glutamatede carboxylase,GAD)和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)酶活性以促使種子萌發富集GABA[12,20-22],其中酸脅迫是相對操作便捷、安全性高、富集效果好的處理方式之一;在存在GABA代謝關鍵底物谷氨酸等的條件下,種子對GABA的富集效果可進一步改善[22],這些經過脅迫富集氨基丁酸的作物種子對開發高GABA含量健康產品具有重要意義。王玉萍等[23]研究了發芽糙米在谷氨酸鈉(MSG)和抗壞血酸(ASA)脅迫下富積GABA的工藝,結果顯示優化條件下GABA富積量可達924.84 nmol/L,相比對照組提高了2.73倍。目前,有關藜麥在MSG和ASA協同處理下萌發富集GABA的研究尚無報道。

本研究以青藜2號藜麥為原料,采用MSG和ASA協同處理藜麥種子萌發富集GABA。通過單因素和正交試驗對影響藜麥GABA含量的萌發溫度、萌發時間、浸泡溫度、浸泡時間等因素進行探討,獲得最佳工藝條件,在此基礎上對萌發藜麥膽酸鹽結合性能進行分析,以期為藜麥萌發及富GABA食品研究提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥(青藜2號) 由青海省農林科學院作物所提供,于陰涼干燥處存放,萌發后置于-18 ℃冰箱儲存備用;GABA標準品(純度≥98.0%) 北京索萊寶科技有限公司;?；悄懰徕c(純度≥97.0%)、甘氨膽酸鈉(純度≥98.0%) 上海源葉生物科技有限公司;糠醛、鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈 色譜級,天津富宇精細化工有限公司;次氯酸鈉、乙酸鈉、硼砂、硼酸 分析純,天津市河東區紅巖試劑廠;2-巰基乙醇、谷氨酸鈉、抗壞血酸、濃硫酸 分析純,上海廣諾化學科技有限公司;試驗中采用水 均為去離子水。

N4S紫外分光光度計 上海儀電分析儀器公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)公司;LRH-150生化培養箱 上海齊欣科學儀器公司;KQ-500DE數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;XL-10B扣壓搖擺式小型粉碎機 天津華鑫儀器廠;DL-5M低速冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器公司;LC-20/40D 3C液相色譜系統 日本島津,配備PDA檢測器和Shim-pack XR-ODS II(2.0 mm×75 mm)色譜柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥萌發處理 稱取20 g藜麥篩選清理并用去離子水清洗后,用4%次氯酸鈉溶液進行種子消毒,再次清洗2次后加入不同濃度的MSG和ASA于25 ℃浸泡12 h。準備鋪有兩層濾紙的培養皿并加入10 mL去離子水浸濕,將處理后的藜麥種子均勻鋪在培養皿,放入25 ℃培養箱進行暗發芽,萌發期間每隔12 h均勻加入10 mL去離子水。萌發結束后,將藜麥種子預凍后冷凍干燥15 h,打粉過40目篩后待測。

1.2.2 GABA含量測定 參考郭曉蒙等[12]的方法并稍加修改。準確稱取0.5 g萌發藜麥粉于50 mL離心管,以70%甲醇為提取溶劑按1∶20 (g/mL)料液比混合均勻后于50 ℃、500 W條件提取20 min,4000 r/min冷凍離心20 min分離上清液;取上清液200 μL于色譜瓶中,加入1 mLOPA衍生劑后充分振蕩,靜置5 min并用0.22 μm有機濾膜過濾后上機測定。色譜條件:流動相A為0.02 mmol/L乙酸鈉,流動相B為乙腈,流速0.5 mL/min,柱溫38 ℃,檢測波長332 nm,上樣量10 μL。梯度洗脫程序:0～10 min,0%～10% B;10～30 min,10%～80% B;30～40 min,80%～100% B。標準溶液梯度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL,試驗重復3次,以色譜峰面積對濃度做標曲,實際樣品GABA含量利用標曲方程計算。

1.2.3 單因素實驗 稱取20 g清理后的藜麥種子,分別以MSG(0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL)和ASA(0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)浸泡后進行萌發試驗,優選MSG和ASA濃度;浸泡溫度25 ℃、浸泡時間12 h、萌發溫度25 ℃、萌發時間48 h,根據“1.2.2”方法測定GABA含量。在最佳濃度下,配制MSG和ASA混合溶液浸泡處理藜麥并萌發;探討浸泡時間(0、2、4、6、8、10、12 h)、浸泡溫度(20、25、28、30、35 ℃)、萌發時間(0、12、24、36、48、60、72 h)及萌發溫度(20、25、28、30、35 ℃)對藜麥脅迫富集GABA的影響,試驗中各因素的固定條件為浸泡溫度25 ℃、浸泡時間為12 h、萌發溫度25 ℃、萌發時間48 h;對照組藜麥以去離子水處理萌發,其中浸泡時間探討及優化工藝參數下驗證組對照樣浸泡時間為6 h,其他對照樣處理條件均為上述單因素實驗固定條件;GABA含量按照“1.2.2”測定。根據單因素實驗,篩選主要影響因素的主要水平開展正交試驗。

1.2.4 正交試驗設計 通過L9(34)正交設計對藜麥MSG/ASA脅迫萌發富集GABA的工藝進行優化,根據試驗情況選擇浸泡時間(A)、浸泡溫度(B)、萌發時間(C)和萌發溫度(D)4個因素,各因素取3個水平,建立四因素三水平正交試驗因素水平表,見表1。樣品按“1.2.2”方法測定GABA含量,結合極差和方差分析對不同因素的影響及最優工藝進行分析,試驗重復3次。

表1 藜麥萌發正交試驗因素設計水平表Table 1 Factor and level of orthogonaldesign for quinoa germination

1.2.5 MSG和ASA脅迫萌發藜麥膽酸鹽吸附能力分析 采用糠醛比色法[24-25]測定樣品膽酸鹽結合量。膽酸鈉(?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉)標準溶液濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL。稱取0.5 g不同處理藜麥粉(藜麥原粉表示為LMYF,去離子水萌發藜麥表示為WAMF,最優條件下脅迫萌發藜麥表示為XPMF),分別加入含有0.1 g膽酸鈉的0.15 mol/L的NaCl溶液50 mL,混勻后于37 ℃恒溫水浴中低速振蕩吸附0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h,取出靜置后準確吸取樣液1.0 mL,3000 r/min離心5 min后取上清液待測。測定方法:取處理樣液0.5 mL于10 mL帶塞試管中,加入0.5 mL去離子水后,依次加入6.0 mL 45%的硫酸和1.0 mL 0.3%的糠醛,混勻后置于65 ℃恒溫水浴中反應30 min,冷卻至室溫后于620 nm處測定吸光度值,繪制標準曲線,計算吸附前后膽酸鈉濃度。膽酸鈉吸附量按式(1)計算。

Q=(C0-2×C1)×50/m1

式(1)

式中:Q為藜麥粉對膽酸鈉吸附量(mg/g);C0為吸附前溶液中膽酸鈉的濃度,mg/mL;C1為吸附后溶液中膽酸鈉的濃度,mg/mL;2為樣品的稀釋倍數;50為吸附試驗中膽酸鹽溶液體積,mL;m1為藜麥粉質量,g。

1.3 數據分析

所有試驗重復3次,結果以平均值表示,圖表采用Microsoft Excel繪制,正交試驗結果采用PASW Statistics 18軟件分析。

2 結果與分析

2.1 MSG和ASA最佳濃度的確定

MSG濃度對發芽藜麥GABA含量的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著MSG濃度的增大,藜麥中GABA含量先升高后趨于穩定。MSG濃度在0～2.0 mg/mL之間GABA含量有一定增加,MSG濃度2.0～4.0 mg/mL時,萌發藜麥中GABA含量無顯著性差異(P>0.05),MSG濃度2.0 mg/mL時,富集GABA的水平最高,為1.043 mg/g,是對照組藜麥的1.46倍。萌發與GAD等酶的活性有關,而谷氨酸(Glu)是該代謝過程的關鍵底物,一般作物種子本身含有一定量的Glu,隨著萌發過程進行,蛋白質發生分解產生新的Glu,這些Glu均為GABA生物合成的基礎[23]。萌發初期種子內Glu含量較低,GAD被激活合成GABA能力有限,當浸泡處理種子吸收利用MSG后組織細胞內Glu含量上升,GABA合成能力增強,含量增加。然而,當內部組織Glu飽和后種子首先會利用內源Glu,加入MSG將不再促進酶促反應底物的富集[23]。因而,結合生產實際選擇2.0 mg/mL MSG用于后續藜麥種子處理。

圖1 MSG濃度對萌發藜麥GABA含量的影響Fig.1 Effect of MSG concentration onGABA content in germinated quinoa

ASA濃度對發芽藜麥GABA含量的影響如圖2所示。由圖2可知,不同濃度ASA對萌發藜麥中GABA含量的影響存在明顯差異。ASA濃度在0～6.0 mg/mL之間變化時,藜麥中GABA含量呈現波動增加的趨勢,當ASA濃度為6.0 mg/mL時達到最高水平1.069 mg/g,為對照組的1.44倍;當ASA濃度高于6.0 mg/mL時,GABA含量顯著降低(P<0.05)。植物組織中GAD酶和轉氨酶的最適pH分別為5.0～6.0和9.0,當加入適量酸增加H+可對種子萌發形成逆境,促進GABA積累,但是當酸濃度過高時可能會使藜麥種子pH偏低,抑制GAD等酶的活性,從而抑制了GABA的生成[26]。

圖2 ASA濃度對萌發藜麥GABA含量的影響Fig.2 Effect of ASA concentration onGABA content in germinated quinoa

綜上所述,MSG濃度2 mg/mL和ASA濃度6 mg/mL為藜麥浸泡較優水平,因此后續試驗中選擇該濃度組合來配制工作液以浸泡處理藜麥。

2.2 浸泡時間與浸泡溫度對藜麥GABA含量的影響

浸泡時間對發芽藜麥GABA含量的影響如圖3所示。由圖3可知,萌發藜麥中GABA含量隨著浸泡時間的延長而先增大后減小,當浸泡時間為6 h時,GABA含量達到最大值1.577 mg/g,為對照樣品的2.07倍,表明浸泡6 h富集GABA效果較好。浸泡0～6 h過程中,藜麥種子不斷吸收MSG和ASA,為藜麥的萌發提供了底物儲備,同時低氧浸泡環境中GAD等酶受H+激活影響活性增強,因此隨著浸泡后萌發的進行,藜麥GABA含量水平明顯提高。當浸泡時間大于6 h后,藜麥種子吸收過量的MSG和ASA,GABA含量出現一定的降低;一方面是可能隨著浸泡時間的延長,溶液氧被大量消耗,種子發芽力降低[21];另一方面,浸泡使得種子軟化度提高,在長時間低pH、低氧及過飽和環境下GAD及DAO等酶的催化活力損失,抑制了GABA的富集[12,27]。

圖3 浸泡時間對萌發藜麥GABA含量的影響Fig.3 Effect of soaking time onGABA content in germinated quinoa

浸泡溫度對發芽藜麥GABA含量的影響如圖4所示。由圖4可知,不同浸泡溫度對萌發藜麥中GABA含量的影響存在明顯差異。當浸泡溫度在20～25 ℃之間時,藜麥GABA含量快速增加,25 ℃時達到最高水平1.335 mg/g,為20 ℃萌發藜麥的1.64倍,表明25 ℃浸泡有利于GABA富集;在該范圍內隨著溫度逐漸升高,藜麥種子代謝較活躍、酶系活性增加,使得對MSG、ASA及Glu的富集利用加強,萌發藜麥GABA含量明顯提高;當浸泡溫度在25～35 ℃之間時,GABA含量迅速降低,30 ℃后減小較緩慢。當浸泡溫度高于25 ℃后藜麥組織細胞膜控制H+進出的平衡態可能受到影響[23],胞內pH降低使GAD等酶活性降低,GABA代謝被抑制;浸泡溫度高于30 ℃后酶活性降低,同時GABA也可能在較高溫度下破壞,使得GABA含量下降[28]。

圖4 浸泡溫度對萌發藜麥GABA含量的影響Fig.4 Effect of soaking temperatureon GABA content in germinated quinoa

綜上所述,浸泡時間選擇為6 h,浸泡溫度為25 ℃。

2.3 萌發時間與萌發溫度對藜麥GABA含量的影響

萌發時間對發芽藜麥GABA含量的影響如圖5所示。由圖5可知,隨著萌發時間的不斷延長,藜麥GABA含量逐漸升高,48 h達到最大值1.313 mg/g,分別為藜麥種子(0.524 mg/g)和對照組GABA含量的2.50和1.84倍;當萌發時間大于48 h時,藜麥GABA含量呈下降趨勢;除萌發24和36 h、60和72 h藜麥GABA含量分別無顯著差異外(P>0.05),其余均存在顯著性差異(P<0.05)。由上述可知,延長萌發時間并不能提高GABA富集量,在萌發超過48 h后藜麥種子中富集的GABA可能會在轉氨酶的作用下形成琥珀酸半醛,造成GABA含量降低[29],因此萌發48 h有利于藜麥富集GABA。

圖5 萌發時間對藜麥GABA含量的影響Fig.5 Effect of germination timeon GABA content in quinoa

萌發溫度對發芽藜麥GABA含量的影響如圖6所示。由圖6可知,萌發溫度對藜麥中GABA含量的影響存在顯著性差異(P<0.05)。培養溫度在20～25 ℃范圍內,藜麥GABA含量快速增大,25～35 ℃范圍內GABA含量顯著減小(P<0.05),這可能是因為溫度過高后種子酶活性降低及GABA轉化代謝加快,使得GABA含量下降。萌發溫度2 5 ℃時藜麥GABA含量為1.228 mg/g,約為20和35 ℃萌發藜麥的2.5和3倍,因此25 ℃對藜麥萌發富集GABA較有利。

圖6 萌發溫度對藜麥GABA含量的影響Fig.6 Effect of germination temperatureon GABA content in quinoa

2.4 藜麥脅迫萌發條件正交試驗結果

藜麥脅迫萌發富集GABA的正交試驗結果如表2所示。由表2可知,各因素影響的極差大小依次為RD>RC>RA>RB,表明4個探討因素對GABA富集效果的影響大小程度依次為萌發溫度、萌發時間、浸泡時間、浸泡溫度,其中GABA含量最高的組合為A2B2C2D2,即浸泡時間6 h、浸泡溫度25 ℃、萌發時間48 h、萌發溫度為25 ℃,該優化條件下處理藜麥萌發后GABA富集量可達1.613 mg/g。

表2 藜麥萌發不同條件組合對GABA富集的影響Table 2 Effect of different combinations ofquinoa germination condition on GABA enrichment

正交試驗方差分析結果如表3所示。由表3可知,萌發時間(C)和萌發溫度(D)對藜麥富集GABA影響達到了極顯著(P<0.01),浸泡時間(A)和浸泡溫度(B)也存在顯著影響(P<0.05),表明在以MSG和ASA協同處理藜麥萌發富集GABA過程中涉及到的4個影響因子均較為關鍵。由F值和P值可以看出,對GABA含量影響最大的為萌發溫度,影響相對最小的為浸泡溫度。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance(ANVOA)

2.5 萌發藜麥膽酸鹽結合能力分析

萌發前后藜麥對膽酸鹽的結合性能如圖7所示。由圖7A可知,LMYF、WAMF和XPMF三種藜麥粉對?；悄懰徕c的吸附量隨吸附時間的延長而先增大后趨于穩定,吸附平衡時吸附量分別可達177.68、150.25和125.17 mg/g,結合牛磺膽酸鈉的能力依次為未萌發的藜麥原粉LMYF>去離子水萌發的藜麥粉WAMF>脅迫萌發藜麥粉XPMF;由圖7B可知,LMYF、WAMF和XPMF對甘氨膽酸鈉的吸附量同樣隨吸附時間延長而先增大后趨于穩定,平衡吸附量分別為179.53、163.12和144.92 mg/g,結合能力仍以藜麥原粉最強;萌發前后及不同萌發方式下的藜麥總體均保持高的膽酸鹽結合能力。膽酸鹽是體內膽固醇分解后的兩性大分子產物,機體通過吸附膽酸鹽并排出體外可以達到降低體內膽固醇含量和降血脂的目的[14];報道表明GABA本身具有降血脂活性,然而本研究中萌發后藜麥全粉膽酸鹽結合量降低,主要原因是萌發前后的藜麥全粉相比單一GABA物質組成更加復雜,而谷物降血脂活性還來自于其多糖、纖維、蛋白、抗性淀粉等[14,24,30-31],藜麥經過萌發后大分子多糖、蛋白、淀粉等部分發生代謝分解[7],進而可能使萌發粉相比原粉總的體外降脂能力下降。綜上所述,脅迫條件下藜麥萌發活性加強,γ-氨基丁酸明顯富集,而膽酸鹽結合能力會出現一定降低。

圖7 萌發前后藜麥粉對膽酸鹽的吸附Fig.7 Adsorption of bile salts byquinoa flour before and after germination

3 結論

本研究采用單因素實驗和正交試驗,以GABA含量為指標,對藜麥在MSG和ASA協同脅迫下萌發富集GABA工藝進行了優化,并對萌發藜麥膽酸鹽吸附能力進行了探討。最適藜麥浸泡MSG和ASA濃度分別為2和6 mg/mL,優化富集工藝為浸泡時間6 h、浸泡溫度25 ℃、萌發時間48 h、萌發溫度25 ℃,最優條件下萌發藜麥GABA含量可達1.613 mg/g,分別為藜麥種子和對照組的3.07和2.26倍。萌發前后藜麥均具有較強的膽酸鹽吸附能力,其中未萌發藜麥最強,萌發及脅迫萌發后藜麥膽酸鹽結合量有所降低。本研究可為藜麥富集活性GABA組分及開發藜麥健康新產品提供一定的理論依據。