短梗大參多酚的提取及體外抗氧化性研究

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

短梗大參(Macropanaxrosthornii),屬五加科(Araliaceae)、大參屬(Macropanax),又名七角風、七葉蓮、節梗大參,是我國特有的一種小喬木或者常綠灌木,在四川、江西、湖北、貴州、廣西、廣東、湖南、甘肅、福建等地均有分布[1]。文獻記載該植物的根、皮具有驅風除濕、化瘀生新的功效,臨床可用于治療骨折、風濕關節炎、創傷性損傷、嬰兒營養不良等疾病[2]。短梗大參的樹枝韌皮部含有豐富的膳食纖維和多酚,風味清香,在西昌當地有直接食用的習慣。

多酚是具有多個酚羥基化合物的次生代謝產物,廣泛分布于植物的根、皮、葉中,它具有多種生物活性功能,如抗氧化[3-4]、抑菌[5-6]、美容養顏[7]等。多酚常見的提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界流體萃取法[8-11]。與傳統的溶劑提取法相比,超聲波輔助提取能夠縮短反應時間和減少溶劑使用量,增加植物中活性物質的溶出量和提取效率;但超聲過程中產生的空化效應能使多酚發生氧化,導致活性喪失。超臨界流體萃取法對設備的要求高、成本昂貴,在現階段不適合用于大規模的實際生產。

目前,國內大部分的研究著眼于短梗大參的生理學、植物學方面的特性,關于短梗大參多酚的相關報道幾乎沒有。因此,本研究通過對短梗大參多酚提取工藝進行優化和抗氧化性測定,以期為短梗大參保健食品的初步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短梗大參 2019年3月采自四川省涼山州西昌市(樹皮的水分、灰分、纖維素含量分別為4.5%、10.6%和15.7%);沒食子酸 上海邁坤化工有限公司;福林-酚 合肥博美生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Phygene(飛凈)生物科技有限公司;水楊酸 天津致遠化學試劑有限公司;抗壞血酸 天津北聯精細化學有限公司;無水乙醇、甲醇、無水碳酸鈉、30% H2O2等 均為國產分析純。

DHG-9620B恒溫鼓風干燥箱 上海瑯玕實驗設備有限公司;標準檢驗篩 浙江上虞華豐五金儀器有限公司;HSJ-4 A數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 金壇科析儀器有限公司;5840R高速冷凍離心機 Eppendorf中國有限公司;UV 2400型紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 新鮮短梗大參樹皮→切碎→干燥(50 ℃恒溫烘干)→粉碎→過篩(60目)→篩下物→加入提取劑→恒溫水浴振蕩(150 r/min)→離心(5000 r/min、10 min)→定容至50 mL→總酚測定

1.2.2 標準曲線的繪制 參考康超等[12]的方法,采用福林酚法制作標準曲線。精確稱量0.0050 g沒食子酸標準品,用60%乙醇溶液溶解、并定容至10 mL,得到濃度為0.5 mg/mL沒食子酸標準液。用移液槍分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的沒食子酸標準溶液于10 mL離心管,加入1 mL Folin-Ceocalteu試劑,混勻靜置3 min后加入3 mL 10% Na2CO3溶液,并用蒸餾水補齊至5 mL,40 ℃水浴20 min后在760 nm處測定吸光值,同時做空白對照調零。以沒食子酸的質量濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程y=9.185x+0.004(R2=0.9995)。

1.2.3 提取液中總酚含量測定 用移液器移取1.0 mL短梗大參提取液,按1.2.2的方法處理后測定吸光度值,并由標準曲線求得提取液中的總多酚含量,結果以每1 g短梗大參中當量沒食子酸的含量(mEq GA/g)來表示:

式(1)

式中:C為短梗大參多酚質量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;n為稀釋倍數,m0為短梗大參質量,g。

1.2.4 單因素實驗 準確稱取0.500 g短梗大參樹皮粉末于50 mL 燒杯中,按料液比1∶20 (g/mL)加入提取溶劑,在40 ℃恒溫水浴下振蕩60 min后于5000 r/min離心10 min,取上清液定容至50 mL。量取0.2 mL提取液,稀釋5倍后置于試管中,測定多酚的提取量,操作步驟同1.2.2。

1.2.4.1 提取溶劑對短梗大參總酚提取量的影響 固定料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度40 ℃、提取時間60 min,設定提取溶劑為水、無水乙醇、60%甲醇、60%乙醇,研究提取溶劑對短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.2 乙醇體積分數對短梗大參總酚提取量的影響 固定料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度40 ℃、提取時間60 min,設定乙醇體積分數為40%、50%、60%、70%和80%,研究乙醇體積分數對短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.3 料液比對短梗大參總酚提取量的影響 固定乙醇體積分數60%、提取溫度40 ℃、提取時間60 min,設定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL),研究料液比對短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.4 提取溫度對短梗大參總酚提取量的影響 固定乙醇體積分數60%、料液比1∶30 (g/mL)、提取時間60 min,設定提取溫度為30、40、50、60、70 ℃,研究提取溫度對短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.5 提取時間對短梗大參總酚提取量的影響 固定乙醇體積分數60%、料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度50 ℃,設定提取時間為40、50、60、70、80 min,研究提取時間對短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.5 正交試驗 在單因素實驗的基礎上,以乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間為試驗因素,總酚提取量為響應值,采用L9(34)正交表進行正交試驗,其因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定 參考盛周煌等[13]的方法,具體如下:準確稱取0.0060 g DPPH,用無水乙醇溶解并定容到200 mL,得到濃度為75 μmol/L的DPPH溶液,避光保存備用。取1 mL不同濃度梯度的短梗大參多酚提取液于試管中,加入4 mL DPPH溶液,搖勻后在暗處避光放置反應30 min,于波長517 nm處測吸光度值A1。用等量無水乙醇代替DPPH,和樣品液反應測吸光度值A2,空白組以等量提取溶劑代替樣品液,和DPPH反應后測得吸光度值A0,陽性對照用VC代替提取液。 DPPH自由基清除率的計算如式2所示:

式(2)

式中:A1為1 mL 樣品液+4 mL 75 μmol/L DPPH溶液的吸光度值;A2為1 mL 樣品液+4 mL無水乙醇吸光度值;A0為1 mL 提取溶劑+4 mL 75 μmol/L DPPH溶液吸光度值。

1.2.6.2 羥基自由基清除率的測定 羥基自由基清除能力是抗氧化劑還原力、供氫能力和活性氧清除能力的綜合體現,其大小反映了抗氧化劑延緩氧化誘導期開始的能力[14]。羥基自由基清除率的測定參考Zhou等[15]的方法,并加以修改,向25 mL試管中依次加入1.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL去離子水或不同濃度樣液、1.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液,混勻并靜置10 min后加入0.60 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液,混勻、靜置10 min后于510 nm處測定吸光值A0、Ai,同時將H2O2用去離子水代替,測得吸光值Am,陽性對照用VC代替提取液。羥基自由基清除率計算如式3所示:

式(3)

式中:A0為1.0 mL 6 mmol/L FeSO4+1.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液+0.6 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL去離子水的吸光度值;Ai為1.0 mL 6 mmol/L FeSO4+1.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液+0.6 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL樣品液的吸光度值;Am為1.0 mL 6 mmol/L FeSO4+1.0 mL 去離子水+0.6 mL水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL樣品液的吸光度值。

1.2.6.3 半清除濃度(EC50)值的計算 利用SPSS 21.0軟件進行回歸分析,在軟件參數設置中,觀測值匯總選擇100%,模型選擇Logit,響應頻率為清除率,協變量為濃度,選擇對數底為10的轉換,分析處理即可得到EC50值。

1.3 數據處理

每個試驗點平行重復3次,結果以平均值±標準差(Mean±SD)的形式表示。數據顯著性(P<0.05)分析采用SPSS 21.0,圖形的繪制采用Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 提取溶劑對總酚提取量的影響 從圖1可以看出,不同的提取溶劑對短梗大參多酚的提取效果有所不同,其中60%甲醇對短梗大參多酚的提取效果最好,60%乙醇和水次之,無水乙醇的提取效果最差,這與鄭翠萍等提取苦菜多酚的結果(提取效果:乙醇>甲醇>丙酮>水)相反,可能是原料的差異引起[16]。就本次試驗而言,60%甲醇和60%乙醇對短梗大參多酚的提取量分別是0.272和0.265 mEq GA/g,差異不顯著(P>0.05),出于操作安全和成本的綜合考慮,選擇60%乙醇溶液作為短梗大參多酚的后續提取溶劑。

圖1 提取溶劑對總多酚提取量的影響Fig.1 The effect of different solventon extraction yield of total polyphenols

2.1.2 乙醇體積分數對總多酚提取量的影響 從圖2可以看出,多酚提取量呈現先上升后下降的趨勢。乙醇體積分數在40%～60%時,短梗大參多酚提取量隨著乙醇體積分數增加而升高,60%乙醇溶液提取時提取量最大;當乙醇體積分數高于60%時,多酚提取量隨乙醇體積分數的增加逐漸下降,可能是醇溶性物質、色素等在乙醇體積分數較高時溶解度較高,多酚和乙醇-水分子的結合被這些物質抑制。同時,植物的細胞結構也會因乙醇體積分數過高發生失水現象,通透性變低,多酚的滲出受到影響,導致多酚提取量下降[17-18]。

圖2 乙醇體積分數對總多酚提取量的影響Fig.2 The effect of volume fraction ofethanol on extraction yield of total polyphenols

2.1.3 料液比對總多酚提取量的影響 如圖3,料液比在1∶10～1∶30 (g/mL)區間時,短梗大參多酚的提取量隨著提取溶劑用量的增加而升高,料液比為1∶30 (g/mL),短梗大參多酚的提取量最高,為0.318 mEq GA/g,原因可能是固液間的質量濃度梯度是提取物發生轉移的動力,溶劑用量的增加有利于提高質量濃度梯度,提取物的溶出因此得到增加[18],但當料液比達到某一極限時,溶液和原料中的多酚達到平衡狀態,多酚的滲出受到抑制。料液比過高會增加后續的濃縮以及純化成本,所以選擇1∶30 (g/mL)的料液比較為適宜。

圖3 料液比對總多酚提取量的影響Fig.3 The effect of ratioof material to liquidon extraction yield of total polyphenols

2.1.4 提取溫度對總多酚提取量的影響 如圖4所示,在一定溫度范圍內,總多酚提取量隨溫度增加而增加,原因可能是隨著溫度升高,顆粒充分溶脹,分子運動加劇,結合的多酚類化合物易于溶出;另外一方面,過高的溫度會破壞多酚的結構,或使多酚發生氧化[19-20]。因此選擇50 ℃作為之后因素的固定條件。

圖4 提取溫度對總多酚提取量的影響Fig.4 The effect of temperatureon extraction yield of total polyphenols

2.1.5 提取時間對總多酚提取量的影響 從圖5可以看出,總多酚提取量隨提取時間的變化呈現先逐漸上升再平緩下降的趨勢。提取時間在40～70 min時,多酚提取量隨著時間的增加而升高,提取時間越長,多酚提取量越高。在70 min時多酚提取量最高,為0.322 mEq GA/g;在60 min時多酚提取量為0.318 mEq GA/g,與70 min下的提取量無顯著性差異(P>0.05);在80 min時,多酚提取量下降,可能是長時間的提取破壞了多酚結構。因此選擇提取時間60 min作為較優水平。

圖5 提取時間對總多酚提取量的影響Fig.5 The effect of time on extraction yield of total polyphenols

2.2 正交試驗結果

2.2.1 極差分析結果 以單因素試驗為基礎,設計L9(34)正交表進一步優化工藝參數。通過EXCEL和SPSS軟件進行分析,利用極差分析法和方差分析法確定最優工藝條件,結果如表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

根據極差值R的大小,對因素進行主次排序,R值越大,表明該因素對多酚提取量的影響越大。由表2比較本試驗中4 個因素的R值,主次從大到小的排序為乙醇體積分數>料液比>提取時間>提取溫度。

2.2.2 方差分析結果 由表3可知,乙醇體積分數、料液比、提取時間對短梗大參多酚提取量都具有顯著(P<0.05)的影響,實驗范圍內的提取溫度無顯著(P>0.05)影響。綜合極差分析結果得出,短梗大參多酚提取的最優條件為A1B3C1D1,即乙醇體積分數50%、料液比1∶40 (g/mL)、提取溫度45 ℃、提取時間50 min為理論上提取短梗大參多酚的最優工藝條件,此組合未在正交表組合里,需做驗證試驗,用于判斷理論最佳組合是否最優。在上述最佳水平組合條件下,重復提取3次,多酚提取量為(0.320±0.02) mEq GA/g,說明最佳工藝條件具備可行性、且重現性好,為提取短梗大參多酚的最優工藝條件。

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal test

2.3 抗氧化活性試驗結果

2.3.1 短梗大參多酚對DPPH自由基的清除效果 從圖6中可看出,短梗大參多酚對DPPH自由基的清除率隨著溶液的質量濃度升高而增加,并且呈現一定的量效關系。在質量濃度在12.5～87.5 μg/mL時,短梗大參多酚對DPPH自由基的清除率略高于等量的VC溶液,繼續增加質量濃度,多酚樣品與VC對DPPH自由基的清除率基本相當。利用SPSS計算出短梗大參多酚和VC對DPPH自由基清除的EC50,分別是43.4和60.6 μg/mL,說明短梗大參多酚具有良好的DPPH自由基清除效果。

圖6 短梗大參多酚對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polyphenols extractedfrom Macropanax rosthornii on DPPH free radical

2.3.2 短梗大參多酚對羥基自由基清除效果 如圖7所示,短梗大參多酚和VC對羥基自由基的清除率都隨著質量濃度升高而增加,在質量濃度12.5～100 μg/mL的區間時,多酚樣品液與VC的清除率并無顯著差異(P> 0.05),兩者的EC50值分別為37.6 和43.7 μg/mL。

圖7 短梗大參多酚對羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polyphenols extractedfrom Macropanax rosthornii on hydroxy radical

3 結論

單因素和正交試驗優化得出短梗大參多酚的最佳提取工藝參數為乙醇體積分數50%、料液比1∶40 (g/mL)、提取時間50 min、提取溫度45 ℃,在該工藝條件下多酚提取量為(0.320±0.02) mEq GA/g。短梗大參多酚對DPPH和羥基自由基均具有良好的清除效果,其EC50值分別為43.4和37.6 μg/mL,與VC的EC50值60.6和43.7 μg/mL相比,短梗大參多酚活性略強于VC。此文仍采用傳統的浸提法,在保護多酚活性不受影響的前提下,尚需開發短梗大參多酚的高效提取方法。本實驗得到的樣品為粗提物,尚需進一步的分離純化以提高有效成分的活性,若作為工業用抗氧化劑,還需開展相關毒性實驗。