綠豆蛋白降血脂水解物的制備及純化工藝

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(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134; 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617)

綠豆原產(chǎn)于中國(guó),又名青小豆、植豆,富含蛋白質(zhì)、淀粉、各種維生素及礦物質(zhì),其中蛋白質(zhì)的含量為22%～26%[1],是小麥、小米和大米的2～3倍。此外,綠豆中賴氨酸含量是禾谷類的2～5倍[2]。近年來(lái),針對(duì)綠豆的研究逐漸從綠豆淀粉和多糖轉(zhuǎn)移到綠豆蛋白及其蛋白水解肽上[3],已有研究表明綠豆蛋白及其水解肽具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功效[4]。馬詩(shī)文等[5]用復(fù)合酶協(xié)同水解法制備綠豆抗氧化活性多肽,得到的多肽具有良好的抗氧化活性;Xie等[6]研究了不同分子量綠豆蛋白水解物的抗氧化活性和對(duì)血管緊張素-I轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用,結(jié)果顯示分子量小于3 kDa的部分具有較好的抗氧化活性和對(duì)ACE更好的抑制作用;Diao等[7]發(fā)現(xiàn)綠豆蛋白水解物對(duì)促炎因子有較強(qiáng)的抑制作用,從而減弱炎癥反應(yīng),起到免疫調(diào)節(jié)作用。

高血脂癥是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝或者轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致的一種慢性疾病,主要指標(biāo)是體內(nèi)甘油三酯或者膽固醇水平高于正常值[8]。血脂水平與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的形成密切相關(guān),已經(jīng)成為現(xiàn)代社會(huì)的高發(fā)病率之一的疾病[9-11]。傳統(tǒng)降血脂藥物往往具有一定副作用,例如他汀類藥物對(duì)肝腎功能會(huì)造成一定的損傷,還會(huì)引起橫紋肌溶解癥等[12];而作為需要長(zhǎng)期服用的降血脂類藥物,價(jià)格昂貴也是限制其發(fā)展的一個(gè)重要原因,因此尋找合適有效的藥品替代物成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[13]。目前已有研究證實(shí)綠豆具有降血脂的作用,Ruvini等用生綠豆、煮熟的綠豆和發(fā)芽的綠豆分別喂食高膽固醇大鼠,發(fā)現(xiàn)煮熟和發(fā)芽的綠豆均可使高膽固醇大鼠血清中非高密度脂蛋白膽固醇濃度降低和高密度脂蛋白膽固醇濃度增加[14];Swee等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵綠豆在高膽固醇小鼠體內(nèi)有抗氧化和降血脂的作用[15];王沛發(fā)現(xiàn)綠豆水醇提取物對(duì)高脂血癥家兔有良好的降血脂效果[16]。膽汁酸是人體中含量豐富的一種固醇物質(zhì),包括初級(jí)膽汁酸(如膽酸)和次級(jí)膽汁酸(如脫氧膽酸),一般以鹽的形式存在,其在脂肪和膽固醇合成中起到重要作用。目前關(guān)于綠豆蛋白水解物的降血脂作用的研究還鮮有報(bào)道,因此以與膽酸鹽結(jié)合能力為出發(fā)點(diǎn),研究綠豆蛋白水解物體外降血脂的作用。

本文采用酶水解的方法,以水解物對(duì)膽酸鹽的絡(luò)合能力為考察指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行水解工藝優(yōu)化,并進(jìn)行超濾純化得到綠豆蛋白降血脂水解物,篩選出降血脂作用較強(qiáng)的水解部分,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用綠豆蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆 津早綠一號(hào)綠豆,采購(gòu)于天津市靜海區(qū);考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白 天津德思化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸 分析純,永飛化學(xué)試劑有限公司;中性蛋白酶(100 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、胰蛋白酶(250 USPu/mg)、復(fù)合蛋白酶(120 U/mg)、脫氧膽酸鈉(>98%)、膽酸鈉(>98%)、牛磺膽酸鈉(>98%) 源葉生物科技有限公司;8×USP豬胰酶 生工生物工程有限公司;其他試劑 購(gòu)于天津市化學(xué)試劑供銷公司;所有試劑 均為國(guó)產(chǎn)級(jí)分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為去離子水。

DH-101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;ME204型電子天平 梅特勒托利多(上海)有限公司;TDA-8002型恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Heraeus Megafuge 8R型離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;多功能讀板機(jī) 美國(guó)Molecular Devices SpectraMax-M5;pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ALPHA1-4LD真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ;超濾管 Sartorius;AKTA Start蛋白質(zhì)層析系統(tǒng) 美國(guó)GE;Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱(長(zhǎng)600 mm,直徑26 mm,填料粒徑為47 μm) GE Healthcare;SHZ-CD型循環(huán)式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理制備 綠豆洗凈烘干,用粉碎機(jī)磨成粉,過(guò)80目篩儲(chǔ)存?zhèn)溆谩０凑?∶15的料液比在綠豆粉里加入PBS緩沖液(pH=10.0),40 ℃超聲輔助提取8 min。將提取液離心(4 ℃,500 r/min,20 min),取上清液,用0.05 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH=4.6,攪拌使沉淀均勻。隨后離心(4 ℃,500 r/min,15 min)棄上清,經(jīng)冷凍干燥后得綠豆粗蛋白[17]。

1.2.2 理化指標(biāo)的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]。多糖含量的測(cè)定采用苯酚硫酸法[19]。

1.2.3 蛋白酶的篩選 采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶5種蛋白酶分別水解綠豆蛋白。控制底物濃度為1 g/100 mL,加酶量10000 U/g,在5種酶的最適pH和最適溫度下水解120 min。隨后,100 ℃水浴加熱5 min滅酶,將各水解液離心(5000 r/min,10 min)取上清液凍干后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩龈傻乃馕锱渲瞥? g/100 mL,以水解物對(duì)膽酸鹽的吸附能力為考察指標(biāo),篩選出制備水解物的最佳蛋白酶。

1.2.4 膽酸鹽吸附實(shí)驗(yàn) 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定[20]:配制0.4 mmol/L的膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液備用。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL帶蓋玻璃瓶中,用0.1 mol/L的PBS補(bǔ)充至2.5 mL。然后加入7.5 mL 60%的硫酸溶液,于70 ℃水浴加熱反應(yīng)50 min后冰浴5 min。分別對(duì)同濃度的3種膽酸鹽進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(200～1000 nm)得到其最大吸收波長(zhǎng)。在最大波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)后溶液的OD值,計(jì)算得到3種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

人工胃液的制備:取1 mol/L鹽酸16.4 mL,加入800 mL純水,再加入10 g胃蛋白酶,搖勻溶解后加水定容至1000 mL。

人工腸液的制備:準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀6.8 g,溶解于500 mL純水中,用0.4%的NaOH溶液將pH調(diào)制6.8,加入豬胰酶5 g溶解后定容至1000 mL。

綠豆蛋白水解產(chǎn)物對(duì)膽酸鹽絡(luò)合能力的測(cè)定[21]:分別取不同條件下的水解產(chǎn)物1 mL(1 g/100 mL),加入1 mL人工胃液,在37 ℃水浴鍋中恒溫水浴60 min。隨后,加入5 mL人工腸液模擬腸環(huán)境,加入4 mL 0.02 mmol/L的膽酸鹽溶液繼續(xù)37 ℃恒溫水浴60 min。底物空白組用0.1 mol/L的PBS代替膽酸鹽。膽酸鹽空白組只加入4 mL 0.02 mmol/L的膽酸鹽溶液,其他用0.1 mol/L的PBS代替。反應(yīng)結(jié)束后將樣品倒入離心管,8500 r/min離心15 min后取上清液2.5 mL,加入7.5 mL 60%的硫酸溶液,于70 ℃水浴加熱反應(yīng)50 min后冰浴5 min。冷卻后在膽酸鹽最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得上清液中膽酸鹽的濃度。并按下述公式進(jìn)行計(jì)算:

式中:W為膽酸鹽結(jié)合率,%;C0為膽酸鹽空白組的濃度,mmol/L;C1為上清液中膽酸鹽的濃度,mmol/L。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取水解時(shí)間(min)、加酶量(U/g)、底物濃度(g/100 mL)、水解溫度(℃)作為考察因素,設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平的實(shí)驗(yàn),以水解物與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為指標(biāo)分別對(duì)這四個(gè)因素的影響進(jìn)行分析。

1.2.5.1 水解時(shí)間對(duì)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制加酶量為10000 U/g,底物濃度為1 g/100 mL,水解溫度固定為45 ℃,考察水解時(shí)間分別為60、90、120、150和180 min時(shí)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.5.2 加酶量對(duì)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制水解時(shí)間為120 min,底物濃度為1 g/100 mL,水解溫度固定為45 ℃,考察加酶量分別為6000、10000、14000、18000和22000 U/g時(shí)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.5.3 底物濃度對(duì)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制水解時(shí)間為120 min,加酶量為10000 U/g,水解溫度固定為45 ℃,考察底物濃度分別為1、2、3、4和5 g/100 mL時(shí)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.5.4 水解溫度對(duì)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制水解時(shí)間為120 min,加酶量為10000 U/g,底物濃度為1 g/100 mL,考察水解溫度分別為35、45、55、65和75 ℃時(shí)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,選取水解時(shí)間(min)、底物濃度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、水解溫度(℃)為影響因素,綠豆蛋白水解物與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力為考察指標(biāo),使用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行表1所示的四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化綠豆蛋白水解的工藝條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.7 水解物超濾分級(jí)和純化 綠豆蛋白水解物離心后的上清液經(jīng)過(guò)5 kDa的超濾管分級(jí)[22]、超濾后分別測(cè)定截留液和透過(guò)液結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力,選取結(jié)合脫氧膽酸鈉能力較好的部分進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱對(duì)水解物的純化分離[23],使用超純水做洗脫液進(jìn)行純化收集。控制洗脫流速為0.8 mL/min,上樣濃度為40 mg/mL,上樣量為1 mL,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集得到的水解物進(jìn)行冷凍干燥后測(cè)定其與脫氧膽酸鈉的結(jié)合率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,使用GraphPad prism軟件、SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。*表示顯著差異,P<0.05;**表示非常顯著差異,P<0.01;***表示極顯著差異,P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆蛋白理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表2所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得提取的綠豆粗蛋白的蛋白含量為78.27%,多糖含量為9.83%。

表2 蛋白和多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 2 Protein and polysaccharidestandard curve regression equation

此外,對(duì)綠豆粗蛋白中黃酮類和皂苷類物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明綠豆粗蛋白中沒(méi)有黃酮類和皂苷類物質(zhì)的存在。基于以上結(jié)果,猜測(cè)剩余11.90%的成分可能是灰分、脂肪、水分等物質(zhì)[24]。

2.2 水解酶的篩選

根據(jù)表3膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算可以得到綠豆蛋白水解產(chǎn)物結(jié)合膽酸鹽的能力,結(jié)果如表4所示。可以看出中性蛋白酶水解綠豆蛋白得到的水解物結(jié)合膽酸鈉、牛磺膽酸鈉的能力最強(qiáng),與脫氧膽酸鈉的結(jié)合率僅次于堿性蛋白酶,且差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明使用中性蛋白酶得到的綠豆蛋白水解產(chǎn)物降血脂能力優(yōu)于其他四種蛋白酶。而這五種蛋白酶水解綠豆蛋白得到的水解產(chǎn)物與脫氧膽酸鈉的結(jié)合率又高于膽酸鈉和牛磺膽酸鈉,便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定,綜合考慮后,選擇中性蛋白酶作為水解綠豆蛋白的最佳酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),并將水解物與脫氧膽酸鈉結(jié)合能力作為考察指標(biāo)。

表3 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 3 Choline standard curve regression equation

表4 不同水解酶水解物的膽酸鹽結(jié)合率Table 4 Percentage of cholate binding ofdifferent hydrolase hydrolysates

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1結(jié)果表明,水解時(shí)間(min)、底物濃度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、水解溫度(℃)對(duì)水解產(chǎn)物膽酸鹽結(jié)合率均具有一定影響。采用中性蛋白酶進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),在水解時(shí)間逐漸增大時(shí)(60～180 min),綠豆蛋白水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力逐漸增大,之后隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)又減小,這可能是由于水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)水解物活性降低導(dǎo)致的;底物濃度為3 g/100 mL時(shí)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力較好,增大底物濃度結(jié)合脫氧膽酸鈉能力反而降低,可能是因?yàn)榈孜餄舛冗^(guò)高影響了底物與酶的接觸面積,從而降低了水解效果,阻礙了降血脂水解物的產(chǎn)生;當(dāng)加酶量為10000 U/g時(shí),水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力較好,加酶量較低時(shí),可能是酶結(jié)合底物的能力較弱,而過(guò)量的酶又使蛋白過(guò)度水解,從而導(dǎo)致水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力下降;溫度的升高使得水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力隨之增加,當(dāng)溫度升高到55 ℃后,水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力最好,之后隨著溫度的升高反而降低。其原因可能是45～55 ℃為中性蛋白酶的最適水解溫度,在此溫度范圍內(nèi)酶活力最高,此外,分子熱運(yùn)動(dòng)隨著溫度的升高而加快并且溶劑的溶解力也增大,更有利于溶劑滲透與溶質(zhì)擴(kuò)散,從而使水解物活性更好。而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶活力降低甚至失活,影響蛋白水解。

圖1 各單因素對(duì)水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響Fig.1 Effect of single factor on the ability of hydrolysate combined with sodium deoxycholate注:不同的字母表示具有顯著性差異,P<0.05。

綜上所述,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取水解時(shí)間120、150、180 min,底物濃度2、3、4 g/100 mL,加酶量6000、10000、14000 U/g,水解溫度45、55、65 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化水解工藝

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表5,每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3組平行,取其平均值。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到水解時(shí)間(A)、底物濃度(B)、加酶量(C)、水解溫度(D)四個(gè)影響因素與響應(yīng)值膽酸鹽結(jié)合率(Y)之間的二次多項(xiàng)回歸擬合方程:

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiment

Y=0.61-0.034A+0.020B+3.472E-003C-0.045D-0.030AB+0.029AC-0.038AD+0.028BC+0.037BD+0.022CD-0.091A2-0.061B2-0.064C2-0.063D2

上述方差分析表中的F值可以用來(lái)描述各個(gè)因素對(duì)水解產(chǎn)物結(jié)合膽酸鹽的影響大小。F值越大,則此因素的影響效果就越強(qiáng)[29]。所以由表6可知各個(gè)因素對(duì)得率的影響大小順序?yàn)?水解溫度(D)>水解時(shí)間(A)>底物濃度(B)>加酶量(C)。

2.4.3 響應(yīng)等高線圖與曲面圖分析 兩個(gè)因素之間交互作用明顯時(shí)等高線形狀趨向橢圓并且其軸線與坐標(biāo)軸之間形成一個(gè)明顯的角度[30]。兩個(gè)因素之間交互作用相對(duì)較弱時(shí)等高線趨向于圓形或者橢圓的軸線與坐標(biāo)軸之間形成的角度相對(duì)較小;響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的變化非常敏感時(shí)其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面坡度陡峭,等高線密集排列;響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的變化相對(duì)來(lái)說(shuō)沒(méi)那么敏感時(shí)其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面坡度平緩,等高線疏松排列[31]。因此,由圖2可以分析看出,四個(gè)因素之間均存在顯著的交互作用。

圖2 各因素交互作用對(duì)水解產(chǎn)物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on the ability of hydrolysate combined with sodium deoxycholate

2.4.4 最佳水解工藝條件的確定與驗(yàn)證 軟件分析得出綠豆蛋白水解產(chǎn)物最佳提取條件為:水解時(shí)間146 min,底物濃度3.1 g/100 mL,加酶量9861 U/g,水解溫度52.1 ℃。在此工藝條件下,軟件預(yù)測(cè)水解物與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為61.86%。進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證,得到實(shí)際結(jié)果為60.46%,與理論值相接近,說(shuō)明響應(yīng)面法具有可行性。

2.5 綠豆蛋白水解物純化

Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱對(duì)水解物的純化分離。將經(jīng)超濾管超濾后的截留液和透出液分別收集,測(cè)定其與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力,結(jié)果表明截留液與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力高于透出液。隨后,將截留液過(guò)層析柱進(jìn)一步分離純化,得到洗脫峰,結(jié)果如圖3所示。每4 mL收集一管,水解物集中在第26～36管。將洗脫峰收集測(cè)定與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力,其活性明顯提高,與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為70.54%,說(shuō)明此部分綠豆蛋白水解物是發(fā)揮降血脂活性的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。純化后活性升高可能是由于純化后一些影響活性的雜質(zhì)被去除,說(shuō)明Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析對(duì)水解物有一定的純化分離效果。

圖3 凝膠色譜圖Fig.3 Gel chromatography

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以綠豆蛋白為原料,從多種蛋白酶中篩選出中性蛋白酶進(jìn)行水解,以其對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力為指標(biāo),得到具有較好降血脂作用的綠豆蛋白水解物。使用中性蛋白酶水解綠豆蛋白得到的水解物降血脂作用更好,可能是因?yàn)槠涿盖形稽c(diǎn)更有利于降血脂水解物的生成。之后采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合的方法優(yōu)化水解工藝,結(jié)果表明最佳水解條件為:水解時(shí)間146 min,底物濃度為3.1 g/100 mL,加酶量為9861 U/g,水解溫度為52.1 ℃,在此條件下得到的水解產(chǎn)物與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為60.46%,與模型預(yù)測(cè)值61.86%的相對(duì)誤差僅為2.26%,說(shuō)明該模型可以較好地描述與預(yù)測(cè)水解綠豆蛋白的最佳工藝條件。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下制備的綠豆蛋白水解物經(jīng)超濾后能得到降血脂活性較好的截留液,說(shuō)明分子量大于5 kDa以上的水解物保留的降血脂活性較好,一方面可能是5 kDa以上的水解物有更大的分子結(jié)構(gòu),能夠吸附更多的膽酸鹽,另一方面,可能是因?yàn)? kDa以上水解物的氨基酸排列順序能夠更好地起到降血脂的作用。使用Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱對(duì)截留液進(jìn)一步分離純化,結(jié)果顯示純化后的水解物降血脂活性更強(qiáng),可能是由于純化后的水解物分子量更集中,更利于與膽酸鹽的結(jié)合。

本實(shí)驗(yàn)為綠豆蛋白水解物降血脂作用的研究提供了一定的理論參考,但關(guān)于綠豆蛋白降血脂水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入的研究。