雪梨枇杷果酒主發酵工藝優化及揮發性成分分析

佟 堯,吳紫薇,陳 娟,劉 驥,唐俊妮

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

枇杷為薔薇科常綠喬木果樹,其果實是枇杷栽培生產和消費者食用的主要經濟器官,我國產量大約占世界枇杷總產量的70%[1]。枇杷果肉含有人體所必需的多種營養成分,是一類營養豐富具有保健功能的果品,并且具有很高的藥用價值[2-4]。雪梨被稱為“百果之宗”,果實飽滿、香脆多汁,含有糖類、脂肪、蛋白質、維生素、礦物質元素及有機酸等多種營養成分。傳統醫學上認為雪梨性味清涼甘甜,入肺,有生津、潤燥、清熱、化痰、保肝、促食欲、助消化、清潔腸道等功效[5-6]。目前,關于枇杷的研究大多是針對枇杷葉和果實的提取物及其功能[7],如枇杷葉中提取的多糖可改善大鼠腎小球損傷[8],枇杷葉提取物對卵清蛋白誘導的小鼠氣道炎癥也有抑制作用[9],枇杷果實提取物則可通過調節糖代謝、脂質代謝、氧化應激、炎癥等預防非酒精性脂肪肝[10]。關于雪梨的研究主要是用于制作功能性飲料等[6,11-12],也有學者提取雪梨多糖運用在卷煙上[13]?？梢?這兩種水果均對人體健康有很大的益處。

自20世紀以來,人們對果酒的興趣日益濃厚[14-15]。有多種多樣的果酒被研發出來,如Tsegay等[16]研制了仙人掌果實發酵酒并對其工藝進行優化;Qi等[17]研制了菠蘿果酒并進行評價。雪梨和枇杷是常見的食補搭檔,關于雪梨枇杷復合發酵酒產品在市場上尚不多見?，F有的研究更多的是單一發酵果酒,如劉紅云等[18]以枇杷為原料釀制枇杷果酒,牛黎莉等[19]以皇冠梨為原料釀制梨果酒。只有少許雪梨和其他種類水果的復合果酒研制,如譚新佳等[20]研制了涼薯雪梨果酒,李瀟等[21]以葡萄和雪梨為原料研制了葡萄雪梨復合果酒。隨著消費意識的提高,消費者逐漸開始青睞更加健康綠色、口感更加符合大眾要求的果酒飲料。

我國枇杷和雪梨品資源豐富,開發雪梨枇杷復合果酒,具有廣泛的市場前景。因此,本文以雪梨和枇杷這兩種營養價值高的水果為原料,研究果酒發酵工藝,并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對復合果酒的揮發性成分進行分析,研制出一種符合現代人需求的復合果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪梨 四川省廣元市;枇杷 四川省德昌縣;安琪葡萄酒果酒專用酵母SY 湖北省宜昌市安琪酵母股份有限公司;偏重亞硫酸鉀 拉曼德工廠;果膠酶(12000 U/g) 寧夏和氏璧生物技術有限公司;無水檸檬酸 濰坊英軒實業有限公司;白砂糖 成都市新紀元食品有限公司;其它試劑 均為國產分析純。

JS30-230多功能攪拌機 蘇泊爾股份有限公司;PYX-DHS·400-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;SC-15數控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C酸度計 成都世紀方舟科技有限公司;果酒酒精度計(0～25%vol) 河北省勝啟儀表廠;2WAY阿貝折射儀 上海精密科學儀器有限公司;UV-6100紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;Thermos氣相色譜質譜聯用儀(配置Triplus進樣系統) 美國Thermos公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果酒制備工藝流程與操作要點

1.2.1.1 果酒制作工藝流程

1.2.1.2 果酒制備操作要點 將采購的雪梨和枇杷剔除病果爛果,清洗后去皮去核,分別破碎打漿,按照雪梨與枇杷為6∶4的比例混合雪梨原漿與枇杷原漿后,立即加入偏重亞硫酸鉀使SO2的添加量為80 mg/L并混合,加入添加量為40 mg/L的果膠酶后,混合均勻并置于40 ℃水浴中酶解2 h;使用白砂糖液將混合漿的糖度調節至23 °Brix,用檸檬酸調節混合漿pH為3.4～3.6;按照0.4 g/L的添加量將酵母加入白砂糖含量為5%的糖液中,在38 ℃下活化30 min,冷卻至28 ℃后加入至混合漿中,混合均勻后在28 ℃下進行主發酵5 d,分離果渣后,獲得雪梨枇杷發酵原酒,進行感官評價、理化性質分析以及微生物分析。

1.2.2 單因素實驗 采用均分法確定每個因素最佳合適量。

1.2.2.1 雪梨與枇杷漿體積比確定 分別將雪梨漿和枇杷漿的比例調至3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3,加入添加量為80 mg/L的SO2,使初始糖度為23 °Brix,調節pH為3.5,加入0.4 g/L的酵母發酵5 d,分離果渣后進行感官評價及理化指標的測定。

1.2.2.2 酵母接種量確定 將雪梨漿與枇杷漿比例為6∶4的復合漿,使SO2的添加量為80 mg/L,調整初始糖度為23 °Brix,pH調節至3.5,分別加入接種量為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的酵母進行5 d的主發酵,分離果渣后進行感官評價及理化指標的測定。

1.2.2.3 SO2添加量確定 將雪梨漿與枇杷漿比例為6∶4,使SO2添加量為60、80、100、120、140 mg/L,調節初始糖度為23 °Brix,pH調整至3.5,加入接種量為0.4 g/L的酵母,進行5 d的主發酵,分離果渣后進行感官評價及理化指標的測定。

1.2.2.4 初始pH確定 雪梨漿和枇杷漿的比例為6∶4,加入80 mg/L的SO2,初始糖度為23 °Brix,調整pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,加入接種量為0.4 g/L的酵母,進行5 d的主發酵,分離果渣后進行感官評價及理化指標的測定。

1.2.3 正交試驗設計 以單因素實驗為基礎,感官評價得分為評分指標,將雪梨與枇杷體積比、酵母接種量、SO2添加量和初始pH采用L9(34)正交實驗法來確定,試驗因子與水平表見表1。

表1 雪梨枇杷復合果酒主發酵工藝的正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for themain fermentation of snow pear loquat compound wine

1.2.4 感官評價、理化指標和微生物指標分析測定方法

1.2.4.1 感官評價指標的測定 由10人組成評定小組,要求具有一定食品感官評價知識基礎,依照表2為評分標準進行評價。

表2 雪梨枇杷復合果酒感官評價標準Table 2 The sensory evaluation criteria for snow pear loquat compound fruit wine

1.2.4.2 理化指標的測定 酒精度測定:酒精度計;pH測定:pH酸度計;還原糖測定:斐林法[22];糖度測定:阿貝折射儀;總酸測定:酸堿滴定法[22];透光率的測定[23]:分光光度法,以蒸餾水作為空白,在680 nm波長處用1 cm比色杯測定透光率T%來反映酒的澄清度;色度測定[24]:分光光度法。

1.2.4.3 微生物指標的測定 菌群總數測定[25]及大腸菌群測定[26]。

1.2.5 雪梨枇杷復合果酒揮發性成分的測定

1.2.5.1 雪梨枇杷復合果酒的前處理 取5 mL雪梨枇杷復合果酒樣于20 mL萃取瓶,加入1 g NaCl促進揮發性成分揮發,加蓋密封,采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入萃取瓶,在80 ℃條件下預孵化30 min,萃取10 min。

1.2.5.2 GC-MS氣相色譜分析 TR-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);分流模式,分流比為20∶1;流速1 mL/min;升溫程序:40 ℃保持3 min,以7 ℃/min升溫至220 ℃并保持2 min;載氣為99.999%氦氣;進樣口溫度230 ℃;解吸時間2 min[27]。

質譜分析條件:電子電離源,電子能量70 eV;離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度220 ℃;全掃描模式,質量掃描范圍30～550 amu。

1.3 數據處理

采用NIST質譜數據庫進行檢索,將檢測出的化合物的結構特征與圖譜進行比對。采用面積歸一化法定量,確定雪梨枇杷果酒里的揮發性成分含量。采用統計軟件SPSS 18.0和Excel處理數據并繪制曲線。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 雪梨與枇杷漿體積比對果酒發酵的影響 雪梨與枇杷漿體積比影響發酵果酒的口感和色澤,從表3可以看出,雪梨比重增加時,透光率也隨之上升,果酒酒體清澈透亮。結合圖1和表3可以看出,當梨與枇杷的比例為6∶4時,在發酵終點時酒精度達到9%vol,其透光率為最高,為92.60%;感官評價中,雪梨與枇杷體積比為6∶4的果酒較好地中和了雪梨與枇杷的味道,既有梨的清香,又有枇杷的甘甜,酸甜適中,無苦澀口感,其色澤呈淡橘黃色,色澤明亮,因此選擇雪梨枇杷體積比為6∶4。

圖1 不同雪梨枇杷體積比對酒精度的影響Fig.1 Effect of different snow pearand loquat volume ratio on alcohol degree

表3 不同雪梨枇杷體積比下果酒品質的比較Table 3 Comparison of the fruit wines quality with different ratios of snow pear and loquat

2.1.2 不同酵母接種量對果酒發酵的影響 酵母接種量過高時,會導致發酵速度過快,果酒風味變差,接種量過低,會延長發酵周期[28]。結合圖2和表4可以看出,當接種量為0.2 g/L時,發酵速度緩慢,酒精度低,在感官評價中果味重于酒味。當接種量等于1.0 g/L,在發酵過程中,前期發酵速度明顯快于其它接種量,發酵液中糖被消耗掉,最后發酵結束時,酒精度偏低。在接種量為0.6、0.8 g/L的時候,雖然酒精度較高,但在感官評定中酒體呈現黃棕色,口感發澀、發苦。當接種量為0.4 g/L時,發酵程度適中,呈現良好的理化指標,透光率高達91.70%,酒體清澈透亮,純正柔和,顏色為雪梨枇杷果酒應有的淡黃色澤,口感爽口。因此接種量選擇為0.4 g/L。

表4 不同酵母接種量下果酒品質的比較Table 4 Comparison of fruit wine quality with different proportion of yeast inoculation amounts

圖2 不同酵母接種量下酒精度的變化Fig.2 Effects of yeast inoculationamounts on alcohol degree

2.1.3 不同SO2添加量對果酒發酵的影響 SO2能抑制酒體中微生物生長,SO2添加量低,對微生物的抑制能力弱,易導致酒體被污染,SO2添加量高,降低或抑制酵母菌的生長,無法發酵完全。由表5可知,當SO2添加量大于80 mg/L時,酒精度與透光率降低,糖度升高,說明此時SO2的含量過高,已經導致酵母細胞的活性降低。由圖3可知,當SO2添加量為80 mg/L時,發酵程度高,到達發酵終點時,酒精度明顯高于其他添加量。添加量為80 mg/L時,抑制了其它不利于發酵的微生物生長的同時,給予酵母細胞一個良好的生長環境,此時酵母細胞生長狀態較為活躍,酒體發酵效果好。因此,SO2添加量選擇為80 mg/L。

表5 不同SO2添加量下果酒品質的比較Table 5 Comparison of wine quality with different SO2 addition amounts

圖3 不同SO2添加量下酒精度的變化Fig.3 Effect of SO2 addition amounts on alcohol degree

2.1.4 初始pH不同對果酒發酵的影響 初始pH的不同會導致酵母細胞表面帶電狀態不同[29],影響酵母細胞的新陳代謝和發酵效率[28],進而影響果酒的品質。從圖4可知,隨著pH上升,酒精度也在上升,在pH為4.0時到達最高點,其余初始pH在發酵過程中酒精度變化波動大,折線圖增長時快時慢,不平穩。在感官評價中,pH越低,口感越酸澀,甜味越淡。結合圖4和表6可知,當pH為4.0時,發酵過程平穩,易于控制,酒味較為濃郁,有明顯的果香,酸甜適宜,更符合對于果酒的感官要求。因此,pH選擇為4.0。

表6 不同初始pH下果酒品質的比較Table 6 Comparison of wine quality different proportion of initial pH value

圖4 不同初始pH下酒精度的變化Fig.4 Effects of initial pH value on alcohol degree

2.2 主發酵工藝參數的正交優化

由表7可知,各因素對雪梨枇杷復合果酒的影響大小為D>C>B>A,即初始pH>酵母接種量>雪梨枇杷體積比>SO2添加量,說明初始pH是影響雪梨枇杷復合果酒的重要因素,綜合各因素下雪梨枇杷復合果酒的品質性狀,并結合感官評價指標確定雪梨枇杷復合果酒的最佳工藝組合為A2B2C2D1,即SO2的添加量為80 mg/L,雪梨枇杷體積比為6∶4,酵母接種量為0.4 g/L,初始pH為3.5。在相同實驗條件下對A2B2C2D1組合進行驗證實驗,得到感官評價分數為91分。

表7 雪梨枇杷復合果酒主發酵工藝的正交試驗結果Table 7 The orthogonal experiment results of the mainfermentation process with snow pear loquat compound fruit wine

2.3 雪梨枇杷復合果酒理化性質

參照正交實驗優化后的最佳工藝組合條件,進行4組平行驗證實驗,5 d發酵結束后,最終得到果酒總酸平均值含量為7.60 g/L(以醋酸計算),剩余還原糖量平均值為8.32 g/L,pH平均值為3.56,透光率平均值為91.5%,酒精度平均值為9.51%vol,顏色強度為1.464。

2.4 雪梨枇杷復合果酒微生物指標檢測

從表8中可知,雪梨枇杷復合果酒的菌群總數為11 CFU/mL。大腸菌群檢測中,所有稀釋度VRBA平板均無菌落生長,按標準要求,以小于1乘以最低稀釋倍數計算,因此雪梨枇杷復合果酒中大腸菌群小于10-9MPN/mL,以上微生物檢測指標均符合NY/T 1508-2017《綠色食品果酒標準》[30]。

表8 雪梨枇杷復合果酒微生物指標檢測結果Table 8 The detection results of microbial indicatorsfor snow pear loquat compound fruit wine

2.5 雪梨枇杷復合果酒揮發性化合物結果與分析

經正交實驗優化過工藝參數的雪梨枇杷復合果酒揮發性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖5,鑒定出的主要揮發性成分以及部分揮發性成分見表9。

表9 雪梨枇杷復合果酒中揮發性成分分析結果Table 9 Analysis results of volatile flavor components in snow pear loquat compound wine

圖5 雪梨枇杷復合果酒揮發性成分GC-MS總離子圖Fig.5 CG/MS total ion current of volatile flavorcompounds ofsnow pear loquat compound wine

經GC-MS分析,綜合圖5和表9,雪梨枇杷復合果酒中能檢測到有保留時間和峰面積的揮發性成分中SI(相似度指數)≥40的有30種,占總檢出揮發性成分的92.18%。從表9中可以看出,其中酸類物質5種(3.77%),酯類物質15種(16.51%),醇類物質7種(71.31%),其他化合物3種(0.59%)。相對含量較大的有8種,分別為乙醇(57.35%)、異戊醇(8.95%)、癸酸乙酯(7.47%)、月桂酸乙酯(3.70%)、苯乙醇(3.37%)、辛酸乙酯(2.14%)、正癸酸(2.02%)、2-甲基-1-丙醇(1.17%),占雪梨枇杷復合果酒中總揮發性成分總量的86.17%。

梨果肉中的主要揮發性成分為醇類[31],枇杷果肉中的主要揮發性成分為醛類[32],與其相比,雪梨枇杷復合果酒中含量較高的揮發性成分為醇類和酯類,共占總揮發性成分的87.82%。發酵過程對酒體產生了影響,醇類和酯類對酒體的香味起著積極的作用。高級醇是酒精飲料中一類重要的揮發性香氣物質[33]。在本實驗雪梨枇杷復合果酒酒體中,高級醇有苯乙醇、異戊醇等醇類物質,其中苯乙醇帶有玫瑰香氣,而異戊醇可使酒體醇厚并具有回甜口感。酒體還含有具有香蕉氣味的乙酸異戊酯、水果香味的正己酸乙酯和辛酸3-甲基丁酯、椰子香氣的癸酸乙酯等酯類物質,使果酒具有美好的水果香氣。

3 結論

本文通過單因素實驗和正交實驗,得出雪梨枇杷復合果酒在主發酵中,各因素對果酒酒精度影響次序為:初始pH>酵母接種量>雪梨枇杷體積比>SO2添加量,最佳工藝組合條件為雪梨枇杷體積比為6∶4,發酵原漿的初始pH為3.5,SO2的添加量為80 mg/L,酵母的接種量為0.4 g/L。此時,果酒總酸含量為7.60 g/L(以醋酸計算),剩余還原糖量為8.32 g/L,pH為3.56,透光率為91.5%,酒精度為9.51%vol。

經過頂空固相微萃取技術結合GC-MS技術分析雪梨枇杷復合果酒中揮發性成分,發現與主要揮發性成分為醇類的梨果肉[29]和主要揮發性成分為醛類的枇杷果肉[30]相比,雪梨枇杷復合果酒中含量最高的揮發性成分為醇類和酯類,一共占總揮發性成分的87.82%,該研究將為雪梨枇杷復合果酒的實際生產和應用提供科學性的理論支持。