桑葚酒中花青素含量的測定方法優化

郭浩然,鄭心怡,張 靜,李小定

(環境食品學教育部重點實驗室,華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

花青素(Anthocyanin)又稱為花色素,在天然狀態下花青素常與各種單糖結合形成花色苷[1]。花青素有較強的體外抗氧化能力,可以作為氧自由基的清除劑,可以保護H2O2引起的細胞凋亡[2]。并且花色苷具有顯著的抗疲勞作用[3],對血糖調節、降低血脂、保護神經系統有重要作用[4],對于治療心血管疾病也具有重要的意義[5]。桑葚富含豐富的營養物質和有效的生物活性物質[6],有明目、保肝、降血壓等作用[7]。桑葚的儲藏性較差,含糖量較高且酸度適宜,是一種較好釀酒原料[8]。近年來,有研究表明,在長時間存放的果酒和果汁中存在一類吡喃型花青素衍生物。這類吡喃型花青素相對于普通花青素呈現出更高的pH、SO2以及儲藏穩定性,具有更加優越的色澤穩定性[9];并且,吡喃型花青素具有一定的抗氧化能力、抗癌和抗炎癥等生理活性功能[10],這些發現均為花青素廣泛應用于食品從而發揮其生理功能提供了新的可能。

常用的花青素分析方法主要有高效液相色譜法、單一pH法、差減法和pH示差法等[11-16]。其中pH示差法的原理是基于花青素在不同pH環境中結構和呈色轉變是pH的函數,而樣品中其他干擾物的特征光譜卻不會隨環境pH變化而變化,通過加入不同pH緩沖溶液后測定吸光值,根據兩者最大的吸光值的差異通過公式計算出花青素的含量[17]。pH示差法測定花青素的含量不需要純度較高的標準品,因此該方法成本較低,并且操作簡便,是花青素定量分析最常用的方法之一。一般在使用pH示差法前,需要對測定波長、使用緩沖液的pH、反應的平衡溫度和時間進行確定,以達到最準確的測定效果。測定波長的確定大多研究方法是選擇花青素處理液的最大吸收波長,通常在520 nm左右;緩沖液pH則是選擇兩個具有最大吸光值差異且較為穩定的pH。pH示差法的反應平衡溫度一般不會選擇較高溫度,因為溫度對花青素的穩定性有較大的影響[18];而對于反應平衡時間,不同研究報道的平衡時間具有一定差異,因為花青素的穩定性與其所處的食品基質的酸度、加工方式有很大關系[19]。

本文在以上研究的基礎上,為獲得發酵酒及其他發酵飲品中花青素測定的優化方法,對pH示差法測定桑葚酒中花青素含量的最佳測定波長、緩沖液的最適pH、平衡溫度和時間等條件進行優化,并進行方法學評價,為今后pH示差法應用于發酵酒中花青素測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚干紅 由湖北省圣源酒業提供;矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品 色譜級,成都瑞芬思生物技術有限公司;乙酸、乙酸鈉、鹽酸、氯化鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑;蒸餾水 實驗室自制。

紫外分光光度計 日本島津有限公司;721可見分光光度計 天津冠澤科技有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 緩沖液的配制 配制不同pH的緩沖液,具體方法參考文獻[14]。pH為0.5和2.0的緩沖溶液的配制:向0.1 mol/L的檸檬酸溶液中逐滴加入鹽酸,并使用pH計校準至所需的pH即可。pH為1.0的緩沖液的配制:0.2 mol/L的氯化鉀溶液和0.2 mol/L的鹽酸溶液以25∶67的體積比混合。pH=4.5的緩沖液的配制:0.2 mol/L的乙酸鈉溶液與0.2 mol/L的乙酸溶液按照體積比1∶1混合后即得。pH=3、4、5、6的檸檬酸緩沖液配制方法見表1。

表1 不同pH檸檬酸緩沖液配制方法Table 1 Different pH citrate buffer configuration method

1.2.2 樣品前處理 將桑葚酒樣品裝入離心管后配平,放置于高速冷凍離心機中,以10000 r/min的速度離心15 min,吸取上層清液待用。

1.2.3 花青素的定量分析 準確吸取離心后的桑葚酒1 mL至20 mL的具塞試管中,分別用pH為1.0和4.5的緩沖溶液定容至20 mL,后置于30 ℃下水浴恒溫40 min,取出試管冷卻至室溫。以蒸餾水為空白對照,分別測定用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋后在519和700 nm下的吸光值,以矢車菊素-3-葡萄糖苷計,按照Fuleki公式計算出桑葚酒中花青素的含量[20]。

ΔA=(A519 nm-A700 nm)pH=1.0-(A519 nm-A700 nm)pH=4.5

式(1)

式(2)

式中:ΔA為桑葚酒中花青素的總吸光值;A519 nm為樣品在519 nm處測定的吸光值;A700 nm為樣品在700 nm處測定的吸光值;DF為稀釋倍數;M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量449.2 g/mol;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數,26900 L·mol-1·cm-1;L為光程,值為1 cm。

1.2.4 樣品測定波長的選擇 分別用pH為1.0和4.5的緩沖液稀釋處理后的桑葚酒樣品,后在520 nm處測定樣品吸光值,使得吸光值在0.2～0.7范圍左右同時不影響緩沖液的緩沖能力下,確定稀釋倍數。后將分別用兩種緩沖液稀釋一定倍數的處理液在370～800 nm進行光譜掃描,根據吸光值的差值確定最佳吸收波長。

1.2.5 樣品測定pH的選擇 用不同pH的緩沖溶液將樣品稀釋至1.2.4中確定的稀釋倍數后,在掃描光譜中的最佳測定波長下測定吸光值,確定最適合的緩沖液pH。要求在最適pH時吸光值左右波動不大、較穩定,且兩個緩沖pH所測吸光值具有最大的差異。

1.2.6 樣品體系反應平衡溫度和時間的選擇 根據1.2.4和1.2.5得到的稀釋倍數和緩沖液的pH,將緩沖液稀釋過的待測液分別置于20、30、40 ℃下,以蒸餾水為空白對照,每隔10 min測定一次在最大吸收波長下的吸光值。

1.2.7 精密度實驗 根據上述實驗所得確定的條件,分別用pH為1.0和4.5的緩沖溶液將樣品稀釋20倍,后置于30 ℃下水浴恒溫40 min,取出試管冷卻至室溫。以蒸餾水為空白對照,分別測定用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋后在519和700 nm下的吸光值。連續8次進行花青素的定量分析,評價條件優化后方法的精確度。

1.2.8 加標回收率實驗 準確稱取一定量的矢車菊素-3-葡萄糖苷的標準品,溶解后用pH示差法測定標準品溶液中花青素的含量,然后進行標準品溶液的二倍和四倍稀釋。取四份處理后的桑葚酒樣品,其中一份直接利用pH示差法測定其花青素的含量。其他3份分別取10 mL,后分別加入0.1 mL的標準品原液、標準品二倍稀釋液和四倍稀釋液。分別用pH示差法測定加入標準品后樣品中花青素的含量,并根據以下公式計算加標回收率。

其中:P為加標回收率;C1為空白式樣測定量;C2為加入標準品后測定含量;C3為加入標準品量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

吸收光譜圖曲線如圖1所示,在370～800 nm的波長范圍下,加入pH為4.5和1.0的緩沖溶液后,兩者吸光值的差值在519 nm處有最大的吸收峰。單一的花色苷在可見區有一個最大吸收峰,且吸收帶范圍較窄,在80～100 nm之間;但是花色苷種類較為復雜時就可能有多個峰值或者更寬的吸收帶范圍[21]。且桑葚酒中花青素經不同pH的緩沖溶液稀釋后,花青素生色團所處的pH環境隨之發生改變,使得掃描光譜在高度和寬度發生變化或者波長發生位移,因此出現由pH變化引起的紫外差光譜現象。有研究表明矢車菊素葡萄糖苷在pH=1.0條件下最大吸收波長為510 nm,而隨pH增加最大吸收波長發生紅移,在中性條件下最大吸收波長為554 nm[22]。而花青素在不同的pH條件下有不同的存在結構形式,當處于pH為1.0的環境條件下,花青素以花色烊離子形式存在,呈現紅色;當以pH為4.5的緩沖液稀釋時,花青素以甲醇假堿形式存在,呈無色[17],所以當樣品其他介質特征光譜不變時,能夠表征由花青素結構變化導致的吸光值差異最大所對應的波長為最佳測定波長,因此519 nm為最佳測定波長。而花青素在700 nm處應無吸收,因此選擇700 nm處作為另一測定波長,以消去食品中其他非花青素成分產生的影響。

圖1 桑葚酒樣品的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectra of mulberry wine samples

此外,針對pH示差法測定花青素的波長,有研究選擇用花色苷標準品而非待測樣品在可見區掃描出的最大吸收波長或緩沖液稀釋標準品后掃描出的最大吸收波長[12,14],但是這種方法忽略了花青素存在的食品介質以及pH變化對掃描結果的影響。也有學者選擇樣品掃描出的在可見區的最大吸收波長[13],但是同樣忽略了pH對花青素結構變化的影響以及pH示差法測定花青素含量的原理。

2.2 測定緩沖液pH的選擇

在519 nm條件下,測定在pH為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的緩沖溶液中桑葚酒樣品的吸光值結果如圖2。由圖2得出,在pH為0.5時具有最大吸光值,且與pH=1.0時吸光值差異不顯著(P<0.05);在pH大于1.0后吸光值逐漸下降,并且于pH=4.5趨于穩定,且有最小的吸光值,pH=4.5之后吸光值無顯著差異(P>0.05)。當pH為0.5和4.5時,具有最大的吸光值的差異,然而考慮到pH為1.0時的吸光值與0.5時吸光值差異不顯著且與2.0時的吸光值不顯著,即pH為1.0左右時具有較為不顯著的吸光值波動,因此使用pH1.0和4.5的緩沖液。

圖2 不同pH條件下桑葚酒樣品的吸光值Fig.2 Absorbance of mulberry wineunder different pH conditions注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 反應平衡時間和溫度的確定

使用pH為1.0的緩沖液將桑葚酒樣品稀釋20倍后,分別放置于20、30、40 ℃下每隔10 min測定吸光值,所得結果如圖3。在30 ℃下,測定樣品的吸光值較穩定,當恒溫水浴40 min后樣品吸光值基本達到平衡。在40 ℃下恒溫10～70 min時,反應體系吸光值出現增加的現象,可能是由于溫度導致花青素損失同時伴隨著褐變指數和聚合物色值的增加導致[23]。而在80 min時出現吸光值下降的現象,這可能是由于溫度使游離型花青素分解。圖4是pH=4.5的緩沖溶液在不同溫度下吸光值隨溫度變化的結果,20 ℃下吸光值隨時間變化的波動較大;30 ℃下水浴恒溫40 min后反應趨于平衡。因此,選擇優化后的反應平衡條件為30 ℃下恒溫40 min。針對pH示差法測定花青素含量的報道選擇平穩溫度和時間一般為20 ℃下平衡100 min左右[12,16],或者是于40 ℃下平衡20～30 min[11,14]。而本文優化后條件相比于之前研究而言,既避免了溫度較高導致花青素穩定性變差,從而降低方法測定的準確性,又縮短了反應體系的平衡時間。

圖3 桑葚酒在pH=1.0條件下的平衡結果Fig.3 Balance results of mulberry wine at pH1.0

圖4 桑葚酒在pH=4.5條件下的平衡結果Fig.4 Balance results of mulberry wine at pH4.5

2.4 精密度實驗

根據上述確定的條件,將桑葚酒樣品使用pH為1.0和4.5的緩沖溶液稀釋20倍,在30 ℃條件下恒溫水浴40 min,后冷卻分別在519和700 nm下測定吸光值,根據公式計算花青素的含量。按照這個方法連續取樣8次,重復測定花青素的含量。結果如表2所示,桑葚酒中花青素含量平均為23.80 mg/L,花青素含量的相對標準偏差(RSD)為2.076%。實驗表明,使用該方法進行桑葚酒中花青素的定量分析重復性好、準確率高。

表2 pH示差法測定桑葚酒中花青素含量精密度實驗結果Table 2 Precision experiment results of anthocyanin content in mulberry wine by pH differential method

2.5 加標回收率

根據上述條件優化后應用pH示差法測定花青素的加標回收率結果如表3所示。當加標量為0.1062 mg時,平均加標回收率為99.59%;當加入0.0531 mg時,加標回收率為102.70%;加標量為0.0266 mg時,平均加標回收率為100.6%。上述加標回收率均在可接受范圍內,該結果表明,優化條件后的pH示差法能夠準確可靠地測定桑葚酒中花青素的含量。

表3 桑葚酒中花青素加標回收率實驗結果Table 3 Anthocyanin recovery experimentresults in mulberry wine

3 討論與結論

針對pH示差法測定波長的選擇,有研究以矢車菊素葡萄糖苷在pH為1.0環境下掃描出的最大波長[12],或是選用矢車菊素葡萄糖苷在pH為1.0環境下的摩爾系數對應的最大吸收波長為最佳測定波長[14],然而這兩種方法均忽略食品介質對花青素掃描結果的影響,波長選擇應該根據具體樣品進行優化。另有研究選擇樣品分別在pH1.0和4.5處的最大吸收波長[13],忽略了環境pH變化會影響花青素結構從而對掃描結果產生影響。本文則選擇樣品在pH為1.0和4.5環境下吸光值差值最大處為最佳吸收波長進行方法優化,具有更好的合理性。緩沖液稀釋桑葚酒處理液掃描后顯示在兩種緩沖液稀釋后都未在可見光區出現吸收峰值,且吸光值大小差異不大,這與其他研究結果有較大出入。筆者認為出現這樣的現象的原因與花色苷所處的介質有很大關系。桑葚酒中花色苷的種類較為復雜,在發酵和后續陳釀等過程中,花色苷和一些糖代謝的中間產物例如丙酮酸以及乙醛等發生反應,形成許多新型的花色苷。已有研究表明在發酵過程中會形成吡喃型花青素、花色雙糖苷、聚合型花青素衍生物等結構的花青素[24-26]。而這些花色苷因結構不同,在顯色性能、吸收波長以及pH穩定性等方面都有所不同。例如Vitisin B會發生較大的吸收波長的位移,吸收波長在490 nm附近,并且顏色呈橙黃色[26];Portisins型吡喃花青素具有極高的pH穩定性,在pH為3.6和1.0的環境下仍具有相同顯色[9]。因此,由于介質不同導致的種類繁多且復雜的花色苷結構組成的樣品體系和較為簡單結構組成的樣品體系獲得的掃描結果必定不同。這也是本文對經過發酵酒或其他發酵處理后的飲品作為花青素介質的樣品進行pH示差法的測定波長條件優化研究的意義之一。

對于反應平衡時間的確定,不同的學者研究結果不同。基于溫度對花青素穩定性有較大影響,不同研究中反應平衡時間確定雖多有差異,但平衡時間都不長。因此,本文確定平衡時間為40 min具有一定合理性。在pH<7.0的環境中花色苷結構不同,化學平衡的時間不同。因此,反應平衡時間的確定除了與溫度有關外,與花色苷的結構密不可分。由此,不同介質對pH示差法的測定條件有極大的影響。

然而,pH示差法測定酒中或者飲料中花青素含量是具有一定局限的,體現在計算中使用的消光系數ε不同。由消光系數不同引起的花青素含量測定結果與真實結果的差異可能是非常顯著的。不同的學者研究中選定的消光系數不盡相同[11-16],然而ε值不僅與選定的基準花色苷有關,也與樣品的基質有關,例如酸度、極性等[27]。因此為保證方法的準確,不同食品基質類型使用pH示差法時具有不同的參數和條件。

本文對桑葚酒中測定花青素含量方法的波長、緩沖液pH以及平衡溫度和時間進行優化,發現消光系數對測定結果會產生一定影響。最佳的條件為:在波長519 nm,緩沖液pH為1.0和4.5,于30 ℃下恒溫40 min。此時測定桑葚酒中花青素的含量為23.80 mg/L。該方法的RSD為2.076%,加標回收率為99.59%～102.70%,表明該方法具有較高的精確性,為發酵酒類食品測定花青素含量提供一定參考。然而,為進一步準確定量分析,應繼續根據食品介質普遍特性確定消光系數,并進一步完善方法。