昆侖雪菊油樹脂成分分析及體內(nèi)外抗氧化性活性研究

楊金梅,王德萍

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046)

昆侖雪菊(Kunlun chrysanthemum)原產(chǎn)于美國的中西部地區(qū),又名金雞菊,主要分布在海拔高度3000 m左右的新疆和田地區(qū),是新疆區(qū)域比較有特色的菊花品種之一,昆侖雪菊主要含有黃酮、多糖、皂苷、氨基酸、揮發(fā)油等成分,具有降血脂、降血壓、抗癌、抗衰老等作用[1-3]。昆侖雪菊油樹脂(Kunlun chrysanthemum oleoresin)是采用超臨界的方法將昆侖雪菊花中的香氣和風味成分萃取出來,再利用溶劑蒸餾回收,制成黏稠狀的昆侖雪菊油樹脂。因為昆侖雪菊油樹脂能代表香辛料中的香氣、有效成分以及風味,幾乎能把香辛料中全部的風味和香氣成分表現(xiàn)出來,因此昆侖雪菊油樹脂在特性和應用方面具備了比昆侖雪菊花更突出的優(yōu)點[4-7]。

自由基是生物體內(nèi)新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類具有高度活性、含有未配對電子的物質(zhì),過量的自由基會導致生物膜、酶、維生素、蛋白質(zhì)及活細胞功能過氧化損傷。氧化應激(Oxidative stress,OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,導致中性粒細胞炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,在體內(nèi)是一種負面作用[8]。而消除氧化應激最有效的方法是使用抗氧化劑[9]。研究表明,油樹脂的成分主要有精油、辛辣成分、色素、樹脂及一些非揮發(fā)性的油脂和多糖類化合物。與精油相比,油樹脂的香氣更豐富,口感更豐滿,具有抗菌、抗氧化等功能。油樹脂能大大提高香料植物中有效成分的利用率。例如,桂皮直接用于烹調(diào),僅能利用有效成分的25%,制成油樹脂則可達95%以上。可見,油樹脂已成為辛香料的重要發(fā)展方向[10-11]。且研究表明,有些草本植物、香辛料以及其提取物具有抗氧化活性[12]。因此,有必要對昆侖雪菊油樹脂進行成分分析及體內(nèi)外抗氧化性活性研究。

本實驗采用超臨界的方法制備昆侖雪菊油樹脂,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術對雪菊油樹脂脂肪酸進行成分分析,通過昆侖雪菊油樹脂對二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、羥基自由基(·OH)的清除率的測定,總還原能力的體外實驗以及測定小鼠血清、肝臟和腎臟中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和總抗氧化(T-AOC)能力的體內(nèi)實驗,從而研究雪菊油樹脂脂的體內(nèi)外抗氧化特性,以期為昆侖雪菊的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆侖雪菊 由新疆和田沙漠玫瑰有限責任公司提供;T-AOC試劑盒、SOD試劑盒、MDA 試劑盒 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) (純度>97%),上海源葉生物科技有限公司;昆明小鼠6～8周齡,體重20±2 g 新疆醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心購買,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2011-0003,新疆維吾爾自治區(qū)科學技術廳頒發(fā);硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇等試劑 均為市售國產(chǎn)分析純。

HH-S24型電熱恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;FW-100高速萬能粉碎機 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;512GD紫外-可見光分光光度計 上海分析儀器總廠;DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;SFE221-50-06超臨界萃取裝置 南通華興石油儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Spe-edTM SFE-2玻璃儀器氣流烘干器 Universal Analytical & Test Instrument Ltd.;QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 昆侖雪菊油樹脂的制備 制備流程[13]:昆侖雪菊花干燥粉末→超臨界CO2萃取→離心(3500 r/min,15 min)→收集上清液→旋蒸乙醇→昆侖雪菊油樹脂。

操作要點:將昆侖雪菊花經(jīng)過電熱恒溫鼓風干燥箱60 ℃干燥,再通過高速萬能粉碎機粉碎成粉末,過60目篩,再通過超臨界CO2萃取。超臨界CO2萃取條件:萃取時間100 min、萃取溫度45 ℃、萃取壓力20 MPa、夾帶劑用量150 mL、CO2流量為20 L/h,從分離釜取出昆侖雪菊油樹脂,在60 ℃的條件下旋蒸去除無水乙醇,得到昆侖雪菊油樹脂。

1.2.2 昆侖雪菊油樹脂脂肪酸成分分析 所得昆侖雪菊油樹脂用無水硫酸鈉脫水,過濾后量取體積。取適量油樹脂用正己烷溶解稀釋為體積分數(shù)0.1%,用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。樣品測定前置于-25 ℃下密封貯存。

1.2.2.1 甲酯化處理 吸取-25 ℃下密封貯存的昆侖雪菊油樹脂3 mL于試管中,加入5 mL石油醚和乙醚(V/V=4∶3)混合溶液,加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL,振蕩,靜置10～15 min,加入蒸餾水,靜置分層,取上清液進樣分析。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)進行成分分析。

1.2.2.2 GC-MS條件 通過對色譜柱類型、分流比、程序升溫條件的考察,結(jié)合實驗室前期的實驗條件,最終確定GC-MS條件。

GC條件:色譜柱為RTX-50石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始溫度120 ℃,保持10 min,以3 ℃/min,升溫至230 ℃,保持10 min。進樣口溫度250 ℃,出樣口溫度200 ℃,檢測電壓350 V,載氣氦氣(純度>99.999%),進樣量1 μL,分流比20∶1,載氣流速0.8 mL/min。

MS條件:EI離子源,電源溫度200 ℃,電子能量70 eV,發(fā)射電流200 μA,質(zhì)量掃描范圍(m/z):20～550,檢測器電壓為1756 V。

1.2.3 體外抗氧化活性的測定

1.2.3.1 羥自由基清除率的測定 參考李姣等[14]的方法,在10 mL比色管中依次加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵和水楊酸-乙醇溶液,再加入用無水乙醇配制的濃度分別為0.05、0.08、0.2、0.4、0.5、0.8、1 mg/mL的昆侖雪菊油樹脂樣品(陽性對照:特丁基對苯二酚(TBHQ))各2 mL,用微型混合器混勻,最后加入2 mL 1%的過氧化氫,水浴30 min,在510 nm波長處測定吸光度(ΔA),然后根據(jù)下面公式計算清除率:

清除率(%)=[(ΔA0-ΔA)/ΔA0]×100

式中:ΔA0:不加樣品的吸光度;ΔA:加入樣品的吸光度。

1.2.3.2 DPPH自由基清除率的測定 參考Locatelli等[15]的方法,在10 mL比色管中依次加入用無水乙醇配制的濃度分別為0.2、0.4、0.5、1、1.6、2 mg/mL的昆侖雪菊油樹脂樣品(陽性對照:特丁基對苯二酚(TBHQ))各2 mL,再加入2.0 mL 2×10-4mol/L的DPPH·甲醇溶液,將混合溶液劇烈振蕩1 min,在室溫下避光放置30 min后,在517 nm波長處測定吸光度(Ai),然后根據(jù)下面公式計算清除率:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai:樣品液與DPPH·混合液的吸光度;Aj:樣品液與無水乙醇混合液的吸光度;Ac:DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度。

1.2.3.3 總還原力的測定 參考陳晉芳[16]、Baschieri等[17]的方法,在1 mL用無水乙醇配制的濃度分別為0.02、0.04、0.05、0.08、0.2、0.4、0.5 mg/mL的昆侖雪菊油樹脂溶液中依次加入2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液,將混合溶液劇烈振蕩1 min,并在50 ℃下放置20 min,加入2.5 mL 10% TCA溶液,混合振蕩,從中吸取2.5 mL,加入等體積的蒸餾水和0.1% FeCl3溶液,振蕩混勻,靜置10 min,最后在700 nm波長處測定吸光度(A)。以無水乙酸作為空白對照,測吸光度A0。總抗氧化能力可以WA來表示:

WA=A-A0

式中:A0:不加樣品的吸光度;A:加入樣品的吸光度。

1.2.4 體內(nèi)抗氧化活性的測定

1.2.4.1 動物實驗 將健康雄性昆明種小鼠50只在飼養(yǎng)室適應性喂養(yǎng)3 d后,按體重隨機分為5組,每組10只,即空白對照組NC、低劑量組LD(100 mg/(kg bw·d))、中劑量組MD(200 mg/(kg bw·d))、高劑量組HD(300 mg/(kg bw·d)),VC陽性對照組NC+(76 mg/(kg bw·d),空白對照組灌胃給予生理鹽水,其余各組按設定劑量給藥,灌胃體積為0.2 mL/(10 g bw),連續(xù)灌胃28 d。小鼠隔夜禁食,不限制飲水,在小鼠最后一次給藥5 h后摘眼球取血,離心(3000 r/min,15 min),取血清,并4 ℃密閉環(huán)境保存。小鼠處死后,進行解剖取出臟器,立即稱重[18]。

1.2.4.2 抗氧化活性指標的測定 小鼠處死后,立即在冰臺上取肝臟、腎臟,以冰水混合的生理鹽水洗去浮血,用濾紙吸干,用玻璃勻漿器制成組織勻漿,離心機離心(4 ℃,3000 r/min,10 min),分離上清液測定各項指標。同時摘出胸腺及脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、總抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定;具體操作見試劑盒說明。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 昆侖雪菊油樹脂脂肪酸成分分析結(jié)果

由表1可知,昆侖雪菊油樹脂含有四種不飽和脂肪酸,占脂肪酸總量的53.28%。其中亞油酸相對含量達到22.81%,其次為花生二烯酸12.34%,亞麻酸10.84%和油酸7.29%。月桂酸和己酸的相對含量較少,分別為1.59%和2.11%。醫(yī)學研究表明,不飽和脂肪酸有明顯降低高密度脂蛋白血清膽固醇的作用,進而減少高血壓、心臟病及中風等的發(fā)病率[18]。亞麻酸對心血管疾病也有很好的防治作用[19],而亞油酸是人體必需的營養(yǎng)成分[20-21],這可能與昆侖雪菊的降血壓、降血脂作用有關,其作用機理有待進一步的研究。

表1 昆侖雪菊油樹脂脂肪酸GC-MS 分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS analysis offatty acids in the Kunlun chrysanthemum oleoresin

2.2 體外抗氧化活性分析

2.2.1 昆侖雪菊油樹脂清除·OH能力 由圖1可知,在所選濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增大,昆侖雪菊油樹脂及TBHQ對·OH的清除能力均增強。說明昆侖雪菊油樹脂的·OH清除能力與濃度具有依賴性關系。當昆侖雪菊油樹脂和TBHQ的濃度為1 mg/mL時,昆侖雪菊油樹脂對·OH清除率為57.19%,而TBHQ對·OH的清除率則達到79.92%。昆侖雪菊油樹脂對·OH的清除率整體低于TBHQ,TBHQ對·OH清除能力的IC50值為(0.2468±0.0711) mg/mL,而昆侖雪菊油樹脂的IC50值為(0.7768±0.0675) mg/mL,低于TBHQ。這說明昆侖雪菊油樹脂對·OH具有一定的清除能力,但清除能力弱于TBHQ。

圖1 昆侖雪菊油樹脂對·OH的清除能力Fig.1 Scavenging capacity of theKunlun chrysanthemum oleoresin on hydroxyl radical

2.2.2 昆侖雪菊油樹脂清除DPPH·的能力 DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,作為一種穩(wěn)定的自由基,DPPH·可以捕獲其他的自由基。因此,對DPPH·的清除效果可以反映抗氧化劑的供氫能力[22]。由圖2可知,在所選濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增大,昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除能力增強。TBHQ對DPPH·的清除率一直保持平穩(wěn)的狀態(tài),但清除率都在80%以上。昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除率從0.5 mg/mL開始,其增高的速率逐漸變大,當昆侖雪菊油樹脂的濃度達到2 mg/mL時,昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除率為85.46%,而TBHQ對DPPH·的清除率為95.89%。昆侖雪菊油樹脂、TBHQ對DPPH·的IC50值分別為(0.8160±0.2219)、(0.0297±0.1248) mg/mL。可見,昆侖雪菊油樹脂對DPPH·有一定的清除能力,但弱于TBHQ。

圖2 昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除率Fig.2 Scavenging capacity of theKunlun chrysanthemum oleoresinon DPPH·

2.2.3 昆侖雪菊油樹脂總還原力的測定 由圖3可知,在0.02～0.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,TBHQ及昆侖雪菊油樹脂的總還原力均增強。TBHQ的總還原力一直處在上升的趨勢,而昆侖雪菊油樹脂隨著濃度的增大,其總還原力變化并不明顯。TBHQ的總抗氧化能力遠遠強于昆侖雪菊油樹脂。

圖3 昆侖雪菊油樹脂總還原力Fig.3 Total reduction capacity ofthe Kunlun chrysanthemum oleoresin

2.3 體內(nèi)抗氧化活性分析

2.3.1 昆侖雪菊油樹脂對小鼠體重的影響 由表2可知,低劑量組LD、中劑量組MD、高劑量組HD灌胃前后小鼠體重增量分別為10.20、7.76、7.76 g,與空白對照組NC灌胃前后體重增量10.66 g相比,均沒有顯著性差異(P>0.05),說明昆侖雪菊油樹脂的灌胃劑量對小鼠體重影響不顯著。

表2 灌胃前后小鼠體重變化Table 2 Changes in body weight in mice before and after intragastric administration

2.3.2 小鼠血清SOD活力、MDA含量和總抗氧化能力 超氧化物在超氧化物歧化酶(SOD)的催化作用下轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫,能清除超氧陰離子自由基。丙二醛(MDA)在體內(nèi)是自然生成的,是氧化應激的標志物,MDA增加越多可以間接地反映機體細胞受到自由基攻擊的程度越大。總抗氧化能力(T-AOC)反映了機體酶促反應體系和非酶促反應體系總的抗氧化水平[23-25]。因此,當肝臟受到損傷時,SOD活力、總抗氧化能力都有不同程度地降低,而MDA的含量有一定程度地升高。由表3可知,陽性對照組(VC)的SOD活力強于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低劑量組的SOD活力與空白對照組相比沒有顯著性差異,而中、高劑量組差異性均顯著(P<0.05)。陽性對照組(VC)的MDA含量低于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低劑量組血清中MDA含量低于空白對照組,中、高劑量組均達到極顯著水平(P<0.01)。陽性對照組(VC)的總抗氧化能力強于空白對照組,低、中和高劑量組的總抗氧化能力與空白對照組相比沒有顯著性差異,但均強于空白對照組。

表3 昆侖雪菊油樹脂對小鼠血清中SOD、MDA與T-AOC的影響結(jié)果Table 3 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse serum

并且正常小鼠血清中SOD、總抗氧化能力的增強和MDA含量的降低均與昆侖雪菊油樹脂的濃度成依賴性關系。因此,昆侖雪菊油樹脂對小鼠血清中的SOD活力、總抗氧化能力有增強的作用,對MDA的含量有降低的作用,說明昆侖雪菊油樹脂具有抗氧化能力,且濃度越大,抗氧化能力越強。

2.3.3 小鼠肝臟SOD活力、MDA含量和總抗氧化能力 如表4所示,陽性對照組(VC)的SOD活力強于空白對照組,差異性顯著(P<0.05),低劑量組SOD活力與空白對照組相比沒有顯著性差異,而中劑量組SOD活力與空白對照組相比差異性顯著(P<0.05),高劑量組SOD活力與空白對照組相比差異性極顯著(P<0.01)。陽性對照組(VC)的MDA含量低于空白對照組,差異性顯著(P<0.05),低劑量組MDA含量低于空白對照組,差異不顯著,中、高劑量組均達到顯著水平(P<0.05)。陽性對照組(VC)的總抗氧化能力強于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低、中劑量組的總抗氧化能力與空白對照組相比均沒有顯著差異,高劑量組的總抗氧化能力與空白對照組相比差異性顯著(P<0.05),且均強于空白對照組。并且正常小鼠肝臟中SOD活力、總抗氧化能力的增強和MDA含量的降低均與昆侖雪菊油樹脂的濃度成依賴性關系。因此,昆侖雪菊油樹脂對小鼠肝臟中SOD活力、總抗氧化能力有增強的作用,對MDA的含量有降低的作用,說明昆侖雪菊油樹脂具有抗氧化能力,且濃度越大,抗氧化能力越強。

表4 昆侖雪菊油樹脂對小鼠肝臟中SOD、MDA與T-AOC的影響結(jié)果Table 4 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse liver

2.3.4 小鼠腎臟SOD活力、MDA含量和總抗氧化能力 由表5可知,陽性對照組(VC)的SOD活力高于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低劑量組SOD活力與空白對照組相比沒有顯著性差異,而中劑量組差異性顯著(P<0.05),高劑量組差異性極顯著(P<0.01)。陽性對照組(VC)的MDA含量低于空白對照組,差異性不顯著。低、中和高劑量組的MDA含量與空白對照組相比沒有顯著差異,但含量均高于空白對照組。陽性對照組(VC)的總抗氧化能力強于空白對照組,差異性顯著(P<0.05),低劑量組總抗氧化能力低于空白對照組,但差異不顯著,中、高劑量組均達到顯著性水平(P<0.05)。并且正常小鼠腎臟中SOD活力、總抗氧化能力的增強和MDA含量的降低均與昆侖雪菊油樹脂的濃度成依賴性關系。因此,昆侖雪菊油樹脂對小鼠腎臟中SOD活力、總抗氧化能力有增強的作用,對MDA的含量有降低的作用,說明昆侖雪菊油樹脂具有抗氧化能力,且濃度越大,抗氧化能力越強。

表5 昆侖雪菊油樹脂對小鼠腎臟中SOD、MDA與T-AOC的影響結(jié)果Table 5 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse kidney

3 結(jié)論

昆侖雪菊油樹脂脂肪酸成分分析結(jié)果表明:昆侖雪菊油樹脂共檢測出了12種脂肪酸,有4種不飽和脂肪酸,占脂肪酸總量的53.28%,其中亞油酸的相對含量達到22.81%、其次為花生二烯酸12.34%、亞麻酸10.84%和油酸7.29%。體外抗氧化實驗結(jié)果表明:昆侖雪菊油樹脂具有體外抗氧化活性,對·OH及DPPH·均有較強的清除能力,且呈劑量依賴性。昆侖雪菊油樹脂對·OH、DPPH·的IC50值分別為(0.7768±0.0675)、(0.8160±0.2219) mg/mL。體外抗氧化活性與特丁基對苯二酚(TBHQ)相比較弱。體內(nèi)抗氧化實驗結(jié)果表明:昆侖雪菊油樹脂可使血清、肝臟和腎臟實驗組中SOD活力與空白對照組相比時明顯上升,其中高劑量組血清中的SOD活力差異性顯著(P<0.05),肝臟和腎臟中SOD活力差異性均極顯著(P<0.01);MDA含量與空白對照組相比下降,其中血清中的MDA含量差異性極顯著(P<0.01),肝臟中MDA含量差異性顯著(P<0.05);總抗氧化能力與空白對照組相比增強,其中肝臟和腎臟中差異性均顯著(P<0.05)。因此,昆侖雪菊油樹脂可以增強受試動物的抗氧化能力,具有良好的體內(nèi)抗氧化作用。