復合酶制備魚蒸煮液水解肽及其抗氧化活性研究

林煌華,謝友坪,馬瑞娟,石新國,劉樂冕,陳劍鋒

(1.福建省海產品廢棄物綜合利用工程技術研究中心,福州大學,福建福州 350108; 2.福州市海產品高值化利用行業技術創新中心,福州大學,福建福州 350108)

鳀魚(Engraulisjaponicus)是一種生活在溫帶海洋中上層的小型魚類,多分布在我國東海、黃海和渤海,主要產地在閩浙二省。鳀魚肉質細嫩且營養價值極高,其中蛋白含量高達15%～20%[1],含有人體需要的各種氨基酸,尤其賴氨酸含量較高[2-3]。鳀魚的脂肪含量在6%左右,其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量分別占總鳀魚油的9.12%和11.89%[4]。此外,鳀魚還含有多種維生素、微量元素和益生菌[5-6]。鳀魚常被加工成魚干、魚松、魚片、魚露、魚醬油等休閑食品和調味品[7],通過精深加工還可以將其制成魚油等[8]生物保健品。研究表明,鳀魚生物制品不但營養豐富,還具有降血糖、調血脂等功效[9-10]。

由于鳀魚的內源性酶活力較強,魚體容易變質,在捕撈之后需要盡快加工。蒸煮壓榨是鳀魚加工的關鍵步驟之一,在蒸煮過程中會有大量蛋白質、游離氨基酸、多肽、風味物質和微量元素等物質溶解在蒸煮液中,使得蒸煮液營養價值極高。但是,由于海上加工技術和空間的限制,目前這些蒸煮液大都被直接排放,造成一定程度的資源浪費[5]。同時,由于蒸煮液的生物耗氧量(BOD)和化學耗氧量(COD)較高,其排放將嚴重污染海洋生態環境[11]。因此,合理利用鳀魚蒸煮液對提高海洋資源利用率以及減少環境污染具有重要意義。林云等[12]以鯖魚罐頭蒸煮液為原料,采用生物酶解法獲取的生物活性肽能夠抑制血管緊張素轉化酶(ACE)的活性并具有較高的抗氧化性。有研究報道,通過添加外源蛋白酶從低值魚中制備多肽,得到的多肽氨基酸組成平衡且必須氨基酸含量高,可用作保健食品的原料[13-15]。楊帆等[16]采用胰蛋白酶酶解制備孔鰩軟骨蛋白寡肽,結果顯示制備的多肽具有較強的抗氧化性。生物酶解法制備蛋白多肽是目前最有效的手段[17],研究證實,利用復合酶水解蛋白可提高水解度,從而得到更多的小分子多肽[18]。因此,對鳀魚蒸煮液中的蛋白進行回收,并進一步通過復合酶解法制備生物活性肽,可提高鳀魚資源的綜合利用效率。

本研究以鳀魚蒸煮液作為原料,旨在通過外源酶酶解技術制備水解肽,在單因素實驗的基礎上運用中心組合設計法優化復合酶酶解工藝,并對制備獲得的水解肽抗氧化活性進行研究,該實驗結果可為進一步促進鳀魚資源的高值化綜合利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳀魚蒸煮液 福州海匯生物科技實業有限公司;堿性蛋白酶(200000 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 國藥集團化學試劑有限公司;木瓜蛋白酶(800000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;中性蛋白酶(60000 U/g) 北京奧博星生物技術有限責任公司;細胞色素C、抑酞酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、馬尿酸 美國Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;三氟乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司;Sartorius BS 210S電子天平 德國Sartorius公司;高效液相色譜儀 日本島津公司;TGL-15B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 廣東深圳國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳀魚蒸煮液制備水解肽的單因素實驗 前期實驗表明,堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對鳀魚蒸煮液的酶解效果較好,同時在酶添加量為500 U/g(E/S),蒸煮液蛋白濃度為100 g/L時,酶解效果最佳,基于此,本研究考察不同復合酶組合(堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶+胰蛋白酶、堿性蛋白酶+中性蛋白酶、木瓜蛋白酶+胰蛋白酶、木瓜蛋白酶+中性蛋白酶、胰蛋白酶+中性蛋白酶)、酶解溫度(37.5、47.5、57.5、67.5、77.5 ℃)、酶解pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、酶解時間(0、5、15、30、45、60、90 min)、復合酶比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對酶解液三氯乙酸氮溶解指數(Trichloroacetic acid-nitrogen soluble index,TCA-NSI值)的影響,確定最適的單因素條件。制備鳀魚蒸煮液水解肽的酶解單因素實驗的基本條件為:底物濃度100 g/L、溫度57.5 ℃、酶解時間1 h、pH7.5、復合酶比例1∶1。單因素實驗中,改變其中一個因素,固定其他條件,以分析各單因素對TCA-NSI得率的影響。

1.2.2 鳀魚蒸煮液制備水解肽的響應面試驗 在單因素實驗基礎上,利用Design-Expert 8.0.6,根據Box-Benhnken中心組合設計原理,將溫度、pH、復合酶比例(質量比)這3個影響因素作為試驗因素,以TCA-NSI為響應值,設計三因素三水平的正交分析試驗,試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.3 TCA-NSI的測定 TCA-NSI為酶解液經過三氯乙酸(TCA)沉淀后的氮溶解指數,可反映蛋白質的酶解效率。TCA-NSI的測定參考鄭志強[19]報道的方法。

式(1)

1.2.4 蛋白質濃度測定 蛋白質濃度的測定參照潘風光等[20]的雙縮脲法。

1.2.5 多肽分布測定 采用高效液相色譜法進行測定,具體參照GB/T 22729-2008。

1.2.6 鳀魚蒸煮液蛋白肽的體外抗氧化試驗

1.2.6.1 羥自由基清除率的測定 羥自由基清除率的測定參照王爽等[21]的方法,并略作修改。在試管中依次加入0.1 mL不同質量濃度的酶解液、0.4 mL 8.8 mmol/L H2O2、0.4 mL 9 mmol/L FeSO4、0.4 mL 9 mmol/L水楊酸(無水乙醇配制)以及5 mL去離子水,37 ℃反應30 min,于510 nm處測定吸光值A1。未加酶解液的溶液的吸光度以A0表示;以相同體積的蒸餾水代替酶解液設置為空白組,其吸光度以A2表示。以抗壞血酸為陽性對照。

式(2)

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測定 DPPH自由基清除率的測定參考Morales等[22]的方法,并略作修改。在試管中依次加入4.0 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)和0.2 mL不同濃度的酶解液,混勻。室溫靜置暗反應30 min,測定517 nm處吸收值A1。以相同體積的乙醇代替樣品作為空白組,其吸光值以A0表示。以抗壞血酸為陽性對照。

式(3)

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 超氧陰離子自由基清除率的測定參考王艷梅等[23]的鄰苯三酚自氧化法,并略作修改。將1.0 mL不同濃度的酶解液與1.8 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)混勻,室溫靜置10 min,加入0.1 mL 10 mmol/L鄰苯三酚(溶于10 mmol/L HCl),于320 nm處測定吸光值,每隔30 s讀數一次,讀數時間為4 min,斜率設定為鄰苯三酚自氧化速率(ΔA)。實驗組的鄰苯三酚自氧化速率以ΔA1表示;以1.0 mL雙蒸水代替樣品的空白組的鄰苯三酚自氧化速率以ΔA0表示。以抗壞血酸為陽性對照。

式(4)

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次,結果取平均值,實驗結果由平均值±SD表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的鄧肯法(Duncan’s test)分析數據之間的顯著性(IBM SPSS Statistics 24.0軟件),P<0.05表示數據之間具有顯著性差異。采用Origin 8.5軟件作圖,Design-Expert 8.0軟件設計響應面實驗。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 蛋白酶的選擇 由圖1可知,不同復合酶組成(質量比1∶1)對醍魚蒸煮液的酶解效果具有較為明顯的差異。堿性蛋白酶與中性蛋白酶的組合對醍魚蒸煮液的水解能力最強,TCA-NSI可達73.65%,而木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的水解效果最差。由于堿性蛋白酶和中性蛋白酶的催化基團分別是絲氨酸和甘氨酸[24],且鳀魚蒸煮液中甘氨酸和絲氨酸含量高于其他氨基酸[25],因此堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果優于其他復合酶。綜合考慮,選取堿性蛋白酶和中性蛋白酶組成的復合酶進行后續試驗。

圖1 不同復合酶對TCA-NSI的影響Fig.1 Effect of different complex enzymes on TCA-NSI注:堿:堿性蛋白酶,木:木瓜蛋白酶,胰:胰蛋白酶,中:中性蛋白酶;不同小寫字母表示差異顯著,圖2～圖5同。

2.1.2 酶解溫度對TCA-NSI的影響 由圖2可知,當溫度小于57.5 ℃時,隨著溫度的上升,酶解反應加快,TCA-NSI提高;溫度超過57.5 ℃時,TCA-NSI則呈下降趨勢。在一定范圍內,升溫可增加酶的溶解度及酶分子的擴散速度,但過高溫度會破壞蛋白酶空間結構,引起不可逆失活。有研究表明該復合酶在54 ℃的條件下酶解綠豆蛋白效果最佳[26],這可能是由于底物的不同造成最適酶解溫度存在差異。綜合考慮,復合酶的酶解溫度應選擇57.5 ℃。

圖2 酶解溫度對TCA-NSI的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on TCA-NSI

2.1.3 pH對TCA-NSI的影響 酸堿環境會改變酶的空間構型,影響底物與酶的解離狀態,進而影響水解程度。由圖3可知,隨著pH的升高,TCA-NSI呈現先增后緩慢下降的趨勢,在pH為8.5時TCA-NSI最高,為77.55%。有研究表明該復合酶在pH8.5時對綠豆分離蛋白的水解度最高,這與本研究的結果相似[26]。因此,選取pH8.5為最佳酶解pH。

圖3 pH對TCA-NSI的影響Fig.3 Effect of pH on TCA-NSI

2.1.4 酶解時間對TCA-NSI影響 由圖4可知,在反應初期,隨著酶解時間的延長,TCA-NSI迅速增加;當酶解時間超過45 min后TCA-NSI呈現平穩趨勢,即TCA-NSI在45、60和90 min無顯著性差異(P>0.05)。為節省制備時間,選取45 min為最佳酶解時間。

圖4 酶解時間對TCA-NSI的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on TCA-NSI

2.1.5 不同復合酶比例對TCA-NSI的影響 由圖5可知,當堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比例為2∶1、1∶1和1∶2時TCA-NSI無顯著差異(P>0.05),分別是76.25%、73.39%和74.43%,而當比例為1∶3和3∶1時TCA-NSI較低。根據以上結果,可選擇復合酶比例為2∶1、1∶1和1∶2進行后續研究。

圖5 不同復合酶比例對TCA-NSI的影響Fig.5 Effect of different ratio ofcomplex enzymes on TCA-NSI

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果 響應面實驗結果如表2所示,利用Design-Expert 8.0.6將相應的TCA-NSI與各因素進行回歸擬合后,得到溫度(A)、酶解pH(B)、復合酶比例(C)對TCA-NSI的最佳回歸方程為:Y=77.63-3.64A-2.54B-3.70C-0.52AB+0.26AC+1.43BC-17.01A2-10.12B2-5.95C2,R2=0.9993。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 響應面分析 由圖6b、6d、6f可知,在這3組交互作用中,BC(pH和復合酶比例)交互作用最強,其次是AB(溫度和pH)的交互作用,而AC(溫度和復合酶比例)的交互作用最弱,這與表3顯著性檢驗得到的結果一致。由圖6a、6c、6e所示的響應圖可知,3個因素與TCA-NSI呈拋物線關系,即隨著各因素值的增加,TCA-NSI先增加后減小。

表3 回歸方程各項系數的顯著性檢驗和變異數分析Table 3 Significance test and analysis of variance coefficients of regression equation

圖6 溫度、pH和復合酶比例兩兩交互對TCA-NSI影響的響應面圖和等高線Fig.6 Response surface plots and contour plots of interactive effect of temperature,pH and the ratio of complex enzymes on TCA-NSI

2.2.3 響應面優化結果及回歸模型驗證 由Design-Expert軟件得到酶解鳀魚蒸煮液的最佳工藝條件為溫度54.49 ℃、pH8.18、堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比例1.32∶1。為驗證模型的可信度,以及考慮實際操作的方便性,對得到的最優工藝進行調整,將驗證工藝設計為:溫度54.50 ℃、pH為8.20、復合酶比例1∶1,重復驗證3次,響應面預測得到的TCA-NSI為78.32%,而驗證結果為76.51%,與預測值相近,表明該回歸模型能較好地預測鳀魚蒸煮液的酶解情況。

2.3 酶解液中蛋白肽的分子量測定

從表4可知,鳀魚蒸煮液中蛋白質的相對分子質量分布主要集中在大于10000 Da的區域(51.046%),而經過酶解后得到由10～40個氨基酸組成的中長肽鏈(相對分子質量在1500～5000 Da)占10.043%,由2～10個氨基酸組成的小肽鏈(相對分子質量在180～1500 Da)占81.941%,而游離氨基酸占7.336%。這與顧林等[13]研究利用蛋白酶水解魚粉蒸煮液得到80%以上的短肽(10肽以下)的結果相似。由此可知,該復合酶可有效將鳀魚蒸煮液中的大分子量蛋白質水解成小分子多肽,這為通過鳀魚蒸煮液生產功能性食品提供了理論依據。

表4 酶解液與蒸煮液分子量分布Table 4 Molecular weight distribution ofenzymatic hydrolysate and anchovy cooking liquid

2.4 鳀魚蒸煮液水解肽的體外抗氧化試驗

不同質量濃度的酶解液和抗壞血酸對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率隨著質量濃度的增大而顯著增加,呈現出一定的劑量依賴效應(圖7),該結論與石斑魚肉水解肽的自由基清除能力與溶液濃度呈正相關性的結果一致[27]。計算得到蛋白肽對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除率的IC50分別為(2.45±1.03)、(1.37±1.01)和(3.45±1.01) mg/mL。抗壞血酸對上述自由基的清除率分別為(0.06±0.01)、(0.90±0.02)和(0.39±0.02) mg/mL,說明蛋白肽的抗氧化性弱于抗壞血酸,這可能是因為鳀魚蒸煮液的酶解產物是混合物,有些多肽的抗氧化性較弱,拮抗作用抑制了活性。但是,一般認為某種物質的IC50低于10 mg/mL時,說明其具有良好的抗氧化性[28]。因此,本研究制備的鳀魚蒸煮液水解肽具有較強的體外抗氧化活性。

圖7 不同濃度水解肽和抗壞血酸對自由基清除率的影響Fig.7 Effect of different concentrations of hydrolyzed peptidesand ascorbic acid on free radical scavenging rate注:(a)羥自由基清除率;(b)DPPH自由基清除率;(c)超氧陰離子自由基清除率。

3 結論

本文優化了復合酶法酶解鳀魚蒸煮液以獲得水解肽的研究方法,并對水解肽的抗氧化活性進行研究。篩選出制備鳀魚蒸煮液水解肽的較適用復合酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶。復合酶制備鳀魚蒸煮液水解肽的最佳工藝條件為:酶解時間45 min、酶解溫度54.5 ℃、酶解pH8.2、堿性蛋白酶與中性蛋白酶比例1∶1,在此條件下TCA-NSI可達76.51%。鳀魚蒸煮液水解肽中分子量低于1500 Da的小肽占81.941%,而且水解肽具有較強的體外抗氧化活性。本研究的結果表明采用復合酶法可以高效酶解鳀魚蒸煮液,酶解產物可用于開發活性肽產品。