1株鴨3型腺病毒的分離鑒定及fiber基因序列分析

嚴專強 曾凡桂 招麗嬋 王占新 魯俊鵬*

1.溫氏食品集團股份有限公司，廣東新興527400；2.廣東省畜禽健康養殖與環境控制企業重點實驗室，廣東新興527400

腺病毒（Adenovirus，ADV）為線狀雙股DNA 病毒，無囊膜，直徑70～110 nm，呈二十面體對稱。腺病毒粒子由252 個殼粒組成，包含240 個不在頂點的殼粒（六鄰體）和12 個頂點殼粒（五鄰體）。每個五鄰體基底帶有1～2 根被稱為纖絲的纖突（fiber），纖絲的長度與病毒的抗原性相關。感染禽類的腺病毒主要有3 個群，I 群代表株是雞胚致死性孤兒病毒，目前從雞分離到12 個血清型，火雞2 個血清型，鵝4 個血清型，鴨2 個血清型；Ⅱ群主要包括火雞出血性腸炎病毒、大理石脾病毒和雞大脾病病毒；Ⅲ群與減蛋綜合征相關，目前只包含一個成員，即減蛋綜合征病毒[1-2]。

鴨l 型腺病毒是與減蛋綜合癥相關的Ⅲ群腺病毒，鴨2 型腺病毒于1977年從法國番鴨中分離，該病毒抗原與已知的腺病毒不同，是一種新型的禽腺病毒[3]。2014年奧地利科學家Marek 等通過高通量測序技術獲得該病毒全序列，該型病毒被正式命名[4]。鴨3 型腺病毒于2014年在我國首次分離，該病毒hexon基因推導的氨基酸序列與鴨2 型腺病毒GR 株同源性僅為60%，且該病毒含有2 個fiber 基因（fiber-1 和fiber-2），而GR 株只含有1 個[5]。為了解鴨3 型腺病毒的流行與變異情況，本研究對近期廣東地區分離的毒株進行了主要免疫原性相關基因序列測定和分析，以期為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

13日胚齡番鴨胚由溫氏食品集團股份有限公司提供；ExTaq 酶、DL 2000 DNA Marker、Prime－Script One Step RT-PCR Kit、pMD-19 T 載體等購自TaKaRa 公司；DNA 提取試劑盒（Stool DNA Kit）購自OMEGA 公司；小牛血清為GIBCO 公司產品，無菌分裝后20 ℃保存備用；DMEM 培養液及胰酶等購自GIBCO 公司。

1.2 臨床樣品處理

2019年10月，廣東某鴨場30日齡番鴨出現肝臟腫大、出血、白色點狀壞死等癥狀。采集發病鴨肝臟置于玻璃研磨器中充分研磨，收集組織懸液于2 mL 離心管中，反復凍融3 次，離心棄沉淀，取上清液通過0.22 μm 濾膜過濾，所得樣本置于-80 ℃保存備用。

1.3 病毒分離

番鴨胚成纖維細胞按常規方法制備，將待分離樣本接種番鴨胚成纖維細胞，每天觀察，72 h 后將細胞凍融3 次再次接種番鴨胚成纖維細胞傳代，盲傳至第5 代，收獲細胞標記為GD2019。

1.4 PCR 鑒定

參照文獻[6-7]分別合成針對鴨3 型腺病毒（DAdV-3）、鴨肝炎病毒（DHV）、呼腸孤病毒（MDRV）、小鵝病毒（GPV）的引物對細胞分離到的病毒進行PCR 檢測，各反應溫度見表1。擴增產物用1 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統照像。

1.5 fiber 基因測序與分析

用fiber 基因測序引物（表1）對鑒定為鴨3 型腺病毒的細胞培養物進行擴增，將PCR 產物回收純化后連接于pMD-19 T 載體，轉化至E.coli DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌落，37 ℃過夜搖菌，菌液PCR 鑒定為陽性的樣品送華大基因測序公司進行測序。序列使用DNASTAR 和MEGA 7.0 軟件進行拼接和分析。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

用特異性引物對分離株進行DHV、MDRV 和GPV 的PCR 檢測，均未檢測到陽性，而用DAdV 特異性引物檢測到了陽性病毒（圖1）。

2.2 fiber 基因同源性分析

測序結果顯示，GD2019 株fiber-1 基因全長為1 380 bp，編碼459 個氨基酸，fiber-2 基因全長為1 443 bp，編碼480 個氨基酸。氨基酸序列同源性分析發現，GD2019 株與已報道的鴨3 型腺病毒的fiber-1 和fiber-2 同源性均為100%（表2）。GD2019株fiber-1 與鴨1 型腺病毒、鴨2 型腺病毒、鵝4 型腺病毒和雞4 型腺病毒同源性在12.2%～25.8%之間，GD2019 株fiber-2 與鵝4 型腺病毒和雞4 型腺病毒同源性分別為37.1%和23.7%（表2）。結果表明，鴨3 型腺病毒的fiber 基因非常保守，與其他禽腺病毒同源性較低。

圖1 病毒分離毒株PCR 檢測結果

2.3 fiber 基因進化分析

分別對GD2019 株fiber-1 和fiber-2 基因序列與GenBank 上已發表的不同種屬禽腺病毒的fiber基因進行分子進化分析。結果發現，鴨3 型腺病毒fiber-1 基因聚類在1 個分支，與鴨2 型腺病毒、鴨1型腺病毒以及其他禽腺病毒處于不同分支（圖2）。鴨3 型腺病毒fiber-2 基因與鵝4 型腺病毒親緣關系較近，與其他禽腺病毒親緣關系較遠。

表1 病毒檢測引物

表2 分離株與其他禽腺病毒fiber基因核苷酸序列推導的氨基酸序列同源性比較

圖2 分離株fiber 基因推導的氨基酸序列遺傳進化樹

3 討論

fiber 基因在腺病毒的感染過程中起著關鍵作用，所有感染力強的禽腺病毒都被檢測到含有2 個fiber 基因[8]。缺失fiber-1 后會造成病毒產量下降，腺病毒受體的特異性轉導作用下降，使病毒只能感染禽類細胞，不能感染哺乳動物類細胞；缺失fiber-2 會導致病毒無法增殖、組裝或擴散，不能產生病毒粒子[9]。本研究從臨床發病鴨肝臟中成功分離了1株鴨3 型腺病毒，序列分析發現該型病毒fiber 基因非常保守，且比鴨1 型和鴨2 型腺病毒多1 個基因片段。推測鴨3 型腺病毒感染力比鴨1 型和鴨2 型腺病毒強，這可能是2014年以來該病毒在廣東和福建等地區鴨群中持續流行的原因。

鴨3 型腺病毒的fiber-2 蛋白具有良好的免疫原性。Yin 等[7]在大腸桿菌中表達并純化了鴨3 型腺病毒的fiber-1 和fiber-2 蛋白，免疫攻毒保護試驗結果顯示，重組fiber-2 蛋白免疫組IgY 抗體水平顯著高于fiber-1 組和全病毒滅活疫苗組，重組fiber-2 蛋白免疫可以提供100%的攻毒保護，并完全抑制排毒，優于fiber-1 蛋白和全病毒滅活疫苗。疫苗免疫是針對鴨3 型腺病病毒有效的防控方法，高效疫苗的研發對該病的控制具有重要意義。