氣相分子吸收光譜法測定奶粉中蛋白質(zhì)的含量

(上海安杰環(huán)保科技股份有限公司，上海 219000)

牛奶是多種物質(zhì)(乳糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、肌酐等)的混合物，其成分取決于多種因素，例如基因育種計劃，喂養(yǎng)計劃和氣候條件等。在過去的幾年中，奶酪的消費量增加了，因此奶粉中蛋白質(zhì)含量的測定是該行業(yè)的商品價格設(shè)置的重要因素。利用分光光度法測定總蛋白通常用于多個領(lǐng)域，例如臨床分析、生物化學(xué)、生理學(xué)、醫(yī)學(xué)研究以及許多其他領(lǐng)域。利用凱氏氮法檢測不能區(qū)分牛奶中添加無機含氮物質(zhì)、有機非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)，但是有研究人員發(fā)現(xiàn)用乙酸鋅溶液做沉淀劑，使蛋白質(zhì)沉淀，可以分離蛋白質(zhì)與非蛋白氮，隨后再用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量[1,2]。盡管凱氏定氮法存在兩個主要問題，即完成整個測定需要很長時間，并且有必要進行兩次分析以確定非蛋白質(zhì)氮(NPN)和總蛋白氮(TPN)之間的差異，但是它在食品科學(xué)和技術(shù)中被廣泛使用，是官方認可的標(biāo)準(zhǔn)參考方法[3-5]。因此，建立快速的奶粉中凱氏氮的分析測定方法既有利于研究人員的工作效率，也可以有效的避免食品安全問題的發(fā)生。

現(xiàn)有的奶粉中蛋白質(zhì)的分析標(biāo)準(zhǔn)方法主要有《GB 5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[1]，該標(biāo)準(zhǔn)方法所用原理都是基于分光比色法，樣品消化之后還需要蒸餾吸收，滴定等步驟，耗時耗力；實驗結(jié)果容易受試驗人員手工誤差等因素的影響。氣相分子吸收光譜法是20世紀(jì)70年代興起的一種簡便、快速的分析手段。它具有測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、測定成分濃度范圍寬、抗干擾性能強、不受樣品顏色和混濁物的影響，不需要進行復(fù)雜的化學(xué)分離；所用化學(xué)試劑少，不使用有毒特別是易致癌的化學(xué)試劑，是一種不產(chǎn)生二次污染的新穎分析技術(shù)。該方法已廣泛應(yīng)用于水質(zhì)凱氏氮的分析測定[6]。本研究參考《GB 5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》方法的食品中凱氏氮的消化方法，消化后的上清液進行氣相分子吸收光譜法的測定，為奶粉中凱氏氮的分析提供一種新型的分析方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相分子吸收光譜儀，AJ-3700，上海安杰環(huán)保科技股份有限公司；天平，百分之一天平(杭州萬特衡器有限公司)。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、無水乙醇、鹽酸、次溴酸鹽等(國藥集團)，以上藥品均為分析純。

氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液；控制樣標(biāo)準(zhǔn)溶液等，4℃下密封保存。

1.2 奶粉樣品

隨機購買兩份奶粉樣品，樣品1為雀巢脫脂奶粉(蛋白質(zhì)含量：21.0g/100g)，樣品2為雀巢中老年奶粉(蛋白質(zhì)含量：27.0g/100g)，樣品3為奶粉中蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其商品編號為：BW3832-2 ，蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為:22.84% 相對擴展不確定度(k=2)(%)為6.0。

1.3 儀器工作條件

氣相分子吸收光譜儀工作溫度20～30℃，環(huán)境濕度≤80%；氘燈光源，燈電流300mA，氣源壓力0.2Mpa；載流液為鹽酸(1+3)；PMT負高壓260V，測量方式：峰面積。

1.4 方法原理

1.4.1奶粉中總蛋白氮

將奶粉中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，用次溴酸鹽氧化法，將待測物質(zhì)中的氨氮氧化為亞硝酸鹽氮，并最終生成二氧化氮氣體，通過載氣將二氧化氮氣體載入吸光管進行吸光度檢測，進而得出奶粉中總蛋白氮的含量。

1.5 試驗方法

準(zhǔn)確稱取1.0g奶粉樣品(精確至0.001g)于250mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20mL硫酸，小火加熱，等奶粉樣品完全炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持燒瓶內(nèi)液體微沸，直至溶液變成藍綠色澄清透明，再加熱0.5h，取下放冷，緩慢加水20mL，定容于100mL容量瓶中，混勻備用。移取稀釋后的上清液于50mL樣品管中，在儀器最佳工作條件下上機測試，按照同一方法做試劑空白試驗。

總蛋白質(zhì)氮按照國標(biāo)方法進行計算，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.38[1]。國標(biāo)方法的測定用《GB 5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》方法中的凱氏定氮法進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

配置濃度為0.0000mg/L、0.1000mg/L、0.2000 mg/L、0.5000mg/L、1.0000mg/L、2.0000mg/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，從低濃度到高濃度進行測試。以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，擬合得到氨氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y= 0.118110x+ 0.003283,r= 0.99941，線性系數(shù)完全滿足一般實驗室對于分析的要求。

圖1 氨氮測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢出限

2.2.1儀器檢出限

將產(chǎn)生兩倍噪聲信號時，單位體積載氣或單位時間內(nèi)進入檢測器的組分量稱為檢出限。則檢出限的計算公式為：

D= 2N/S

式中：N—噪聲(mV或A)；

S—檢測器靈敏度；

氣相分子吸收光譜儀器的噪聲為0.0001V,檢測信號為0.1500ABS, 儀器定量限一般為10倍信噪比，因此該儀器對的檢出限為0.0067 mg/L。

2.2.2方法檢出限

利用氣相分子吸收光譜儀重復(fù)重復(fù)測定消化后的空白樣品7次，然后計算 g該方法的檢出限，計算公式如下：

MDL=S×t(n-1,1-a=0.99)

式中：n=重復(fù)測定的樣品數(shù)，S=n次加標(biāo)測定濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，t=自由度為n-1時的Student's t值(可查表得到)，1-a為置信水平，結(jié)果如表1所示，計算出本方法對凱氏氮的檢出限為0.0191 mg/ kg。

表1 空白樣品測定結(jié)果 (n = 7)

2.3 精密度測試及結(jié)果

2.3.1凱氏氮

采用氣相分子吸收光譜法對樣品1、樣品2奶粉中凱氏氮的含量，進行7次測定，結(jié)果如表2所示，氣相分子吸收光譜法測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.49%～0.72%之間，精密度良好。其中樣品1消解液稀釋500倍，樣品2消解液稀釋200倍，樣品3消解稀釋液稀釋400倍。試樣中蛋白質(zhì)的含量(g/100g)=凱氏氮的質(zhì)量*氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)*100。其結(jié)果如表3所示，利用該方法測定的奶粉中蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)果符合樣品要求。所購買的奶粉樣品的測定結(jié)果與商品的營養(yǎng)成分表中的蛋白質(zhì)含量差別較小。

表2 儀器精密度測試結(jié)果 (n = 7)

表3 奶粉中蛋白質(zhì)含量結(jié)果

2.4 加標(biāo)回收率測試

2.4.1凱氏氮

根據(jù)上述樣品凱氏氮含量測試結(jié)果進行加標(biāo)回收率測試，測定結(jié)果如表4所示，本方法檢測奶粉中凱氏氮加標(biāo)回收率為96.35%～100.99%。表明實驗方法得準(zhǔn)確度較高，適用于奶粉中蛋白質(zhì)(凱氏氮法)的檢測分析。

表4 加標(biāo)回收實驗結(jié)果 (n=7)

2.5 與國標(biāo)方法比較及樣品測試結(jié)果

利用國家標(biāo)準(zhǔn)方法-第一法：凱氏定氮法測定以上實際購買的奶粉樣品及標(biāo)準(zhǔn)樣品的蛋白質(zhì)含量。將消解液按照國標(biāo)方法取10mL進行堿化蒸餾，使樣品中氨游離, 用硼酸吸收后利用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.0521mol/L)進行滴定，根據(jù)酸的消耗量計算氮含量,再乘以換算系數(shù),即為蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果如表5所示。

表5 國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果

注：V1，V，V3為國標(biāo)方法一的注釋

由表5可以看出，利用國標(biāo)方法檢測奶粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品測得的結(jié)果為22.8g/100g蛋白質(zhì)含量；而利用氣相分子吸收光譜儀器測定的該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果為22.84g/100g，利用儀器的方法測定7次，RSD為0.21%，結(jié)果更加精確。雖然兩個方法的結(jié)果差別在合理的范圍，但是在國標(biāo)法蒸餾及滴定過程中，操作時間更長，會存在試驗人員的手工誤差，從而影響試驗的結(jié)果。選擇氣相分子吸收光譜儀器來完成這項工作更加便捷。

3 結(jié)論

本研究建立了基于氣相分子吸收光譜法的奶粉中蛋白質(zhì)的定量分析方法。本方法的檢出限較低，加標(biāo)回收率在96.35%～100.99%范圍，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.49%～0.72%范圍，與國標(biāo)方法相比減少了樣品堿性蒸餾以及滴定等工作，大大提高了工作效率，減少了樣品前處理操作的消耗，減少了試驗人員的滴定操作的手工誤差。利用新方法測定的結(jié)果線性范圍寬，分析靈敏度高，而且樣品消解后可以直接利用全自動的氣相分子吸收光譜儀進行測定，操作簡單高效。本工作為奶粉中蛋白質(zhì)凱氏氮法的測定提供了一種新穎的測試手段，也為氣相分子吸收光譜法在食品領(lǐng)域的應(yīng)用拓展提供了重要參考依據(jù)。