Bad聯合Caspase?8促凋亡基因共表達對SK?HEP?1肝癌細胞體外增殖、凋亡、遷移和體內成瘤影響的實驗研究

魯斌 程敏 周凡

1安徽醫科大學附屬巢湖醫院肝膽外科（安徽巢湖238000）；2南昌大學第二附屬醫院（南昌330006）

肝癌是一種高發惡性腫瘤，全世界每年新增肝癌患者約60 萬例，全球超過50%的肝癌新發病例在我國［1］。晚期轉移性肝癌預后差，無治愈可能，中位生存期不足12個月［2］。細胞凋亡與肝癌發生發展關系密切，而如何有效誘導肝癌細胞凋亡成為近年來肝癌研究熱點，例如組織工程技術［3］。Bad 和Caspase?8 是促細胞凋亡關鍵蛋白，能 正反饋調控細胞凋亡信號傳導，進而誘導細胞凋亡發生［4-5］。本研究擬利用基因重組技術構建Bad?Caspase?8 共表達基因，評估Bad 和Caspase?8 蛋白過表達對SK?HEP?1 肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和體內移植成瘤效果影響，探究其作為肝癌治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑人SK?HEP?1 人肝癌細胞系購自南京科佰生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培養基、胰蛋白酶和細胞培養用雙抗試劑均購自美國Gibco 公司，細胞培養耗材購自美國Thermo Scientific 公司，CCK?8 檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，Annexin V?FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；鼠抗人單克隆Bad 抗體、鼠抗人單克隆Caspase?8抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG 二抗均購自美國CST 公司，兔抗鼠β?actin 單克隆抗體購于美國Santa Cruz 公司。通用型蛋白電泳儀（164?5070）采用美國Bio?Rad 公司產品。本研究委托上海吉凱基因公司設計合成Bad?Caspase?8 融合基因及轉染用慢病毒。本研究通過醫院倫理委員會批準，批件號：2016HZ0031。

1.2 Bad?Caspase?8融合基因構建及慢病毒包裝pubmed 基因數據庫查詢Bad 和Caspase?8 基因信息，設計并化學合成Bad?Caspase?8 融合基因序列，PCR 擴增，靶向克隆至慢病毒GV238 載體中，上游引物序列：5'?CGACAAAAGCAAATGCGACAC?3'，下游引物序列：5'?CCTATTATTTCCACGTAGTCTC?3'，PCR 反應條件為：95 ℃預變性120 s；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環35 次。取適量菌液，進行基因測序，比對分析目的基因序列，抽提質粒，包裝過程由自失活型慢病毒包裝系統完成，將Bad?Caspase?8 融合基因載體質粒和包裝質粒共轉染239T 細胞，轉染48 h 后，高速離心，收集含Bad?Caspase?8 融合基因慢病毒顆粒的239T細胞上清液，-80 ℃保存。

1.3 細胞體外轉染SK?HEP?1 肝癌細胞5×105個/mL 種植6 孔板中，每孔2 mL。吉凱基因公司推薦的SK?HEP?1 肝癌細胞最佳轉染復數為75?100，實驗組：5 μg/mL Polybrene+50 μL Bad?Caspase?8 融合基因重組病毒上清液，對照組：5 μg/mL Polybrene+50 μL 陰性對照病毒上清液，空白組：相同體積細胞培養液。本慢病毒轉染質粒中含有GFP 基因，可利用熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，流式細胞儀檢測基因轉染效率。

1.4 蛋白質免疫印跡法檢測蛋白表達提取細胞蛋白，BCA 法測定樣品中總蛋白濃度，上樣量40 μg，110 v 電泳，300 mA 電壓濕轉2 h，5%脫脂奶粉室溫（25 ℃）封閉2 h，剪膜，加入Bad 抗體（一抗）和Caspase?8 抗體（一抗），1∶500 洗膜緩沖液稀釋，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記羊抗鼠二抗，1∶1 000 洗膜緩沖液稀釋，室溫孵育2 h，1∶3 000 稀釋β?Actin 蛋白作為內參，顯色定影，雜交條帶分析。

1.5 CCK?8 檢測細胞增殖情況轉染后72 h，在96 孔板中接種100 μL 細胞懸液，每組6 孔，置于37 ℃細胞培養箱中預培養2 h，每孔加入10 μL CCK?8 溶液，培養箱內孵育3 h，酶標儀測定吸光度（450 nm），每孔復測3 次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況胰酶消化，離心，每管收集2×105個細胞，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer。加入10 μL Annexin V?FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光反應30 min。加入300 μL Binding Buffer，上機測定各組細胞凋亡率。

1.7 細胞遷移實驗細胞轉染72 h 后，Transwell上室中加入100 μL 各組細胞懸液，細胞濃度為1×105個/L，下室加入600 μL細胞培養液。Transwell小室孔徑8 μm，24 h 后，取出Transwell 小室，PBS清洗2 次，然后用95%乙醇固定15 min。PBS 清洗2 次，結晶紫染色30 min，PBS 清洗2 次，用棉簽擦去上室表面附著細胞，倒置顯微鏡下隨機取左、右、上、下、中心5 個視野，記錄穿膜細胞數，計算各組平均數。

1.8 評估體內移植成瘤效果轉染72 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 離心，1640 培養液重懸細胞，調整細胞濃度至1 × 108個/mL，注射于裸鼠背部皮下，按照細胞處理分組，每組4 只，每只注射0.2 mL 細胞懸液，細胞總數約2 × 107個，每3 天卡尺測量瘤塊長徑（a）和短徑（b），單位cm，腫瘤體積=0.5×a×b2，接種15 d 處死裸鼠，完整取出腫瘤對比分析。

1.9 統計學方法研究結果以均數±標準差表示，采用單因素多樣本方差分析進行多組間均數比較，采用t檢驗分析進行組間兩兩比較，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染率慢病毒轉染SK?HEP?1 肝癌細胞效率達到87.7%，熒光顯微鏡下觀察到滿視野綠色熒光（GFP）分布，這種高轉染效率為其后續實驗應用奠定基礎。

圖1 體外慢病毒轉染SK?HEP?1 肝癌細胞效率Fig.1 SK?HEP?1 hepatoma cells were transfected by lentivirus in vitro

2.2 Bad和Caspase?8蛋白表達情況轉染72 h后，蛋白質免疫印跡法檢測，實驗組Bad 和Caspase?8蛋白表達水平均顯著高于對照組和空白組（圖2）。

圖2 各組Bad 和Caspase?8 蛋白表達Fig.2 The expression of Bad and Caspase?8 protein in each group

2.3 細胞增殖活性變化細胞轉染72 h 后，與對照組和空白組相比，實驗組細胞增殖能力明顯降低，實驗組、對照組和空白組OD值分別為0.86 ±0.122、1.89±0.315 和2.01±0.194，（F=40.314，P<0.001，圖3）。

圖3 轉染后細胞增殖活性Fig.3 Cell proliferation after transfection

2.4 細胞凋亡情況轉染72 h 后，與對照組和空白組相比，實驗組細胞凋亡率明顯增加，實驗組、對照組和空白組細胞凋亡率分別為（31.6±2.8）%、（3.2 ± 0.9）%和（2.9 ± 1.1）%，（F= 248.023，P<0.001），對照組和空白組相比差異無統計學意義，（t=0.366，P=0.733，圖4）。

圖4 細胞凋亡率測定Fig.4 The measurement of cell apoptosis

2.5 細胞遷移情況轉染72 h 后，與對照組和空白組相比，實驗組細胞遷移數目明顯降低，實驗組、對照組和空白組細胞遷移數分別為18 ± 3，77±10 和85±11，（F=85.833，P<0.001，圖5）。

圖5 各組細胞遷移情況Fig.5 Cell migration in each group（×）

2.6 體內成瘤效果裸鼠皮下注射后，對照組和空白組裸鼠移植瘤注射生長迅速，6 d 后呈現指數曲線快速生長，到第15 天平均腫瘤體積分別達到（4.4 ± 0.29）cm3和（4.9 ± 0.42）cm3，而實驗組裸鼠腫瘤生長較緩慢，到第15 天平均腫瘤體積僅為（1.6±0.17）cm3，差異有統計學意義，（F=133.443，P<0.001，圖6）。

圖6 體內移植瘤生長曲線分析Fig.6 Growth curve analysis of the transplanted tumor in vivo

3 討論

細胞凋亡由內外源因素觸發死亡程序而導致的細胞死亡過程［6］。細胞凋亡異常與腫瘤起源、進展及預后密切相關，凋亡抑制或減弱是多種癌癥的共同表現，誘導凋亡是目前靶向治療的主要策略之一。研究［7］證實，肝癌細胞凋亡與淋巴轉移、組織學分級和臨床分期均存在顯著相關性，因此直接干預腫瘤細胞凋亡有望成為肝癌治療新手段。

Caspase 家族是細胞凋亡的執行者，通過級聯反應觸發細胞凋亡。Caspase?8 蛋白是細胞凋亡死亡受體途徑的終末剪切酶，通過與死亡配體相似的Caspase 途徑和線粒體依賴途徑激活Caspase?3，從而介導細胞凋亡［8］。同時，活性Caspase?8 可作用于其他Caspase 成員和凋亡相關死亡受體信號通路，并降解相應的胞漿胞核底物，誘導細胞凋亡［9］。Caspase 蛋白表達與肝癌細胞增殖活性呈顯著負相關［10］。如果Caspase?8 活性異常或低下，則出現細胞凋亡異常，從而誘發腫瘤。Bad 蛋白屬于bcl?2基因家族，Bad 活化后可直接穿透線粒體外膜，加速細胞死亡［11］。Bad 蛋白在肝癌組織中低表達而在正常肝組織中表達明顯增加，Bad 蛋白水平與肝癌進展呈負相關［12］。

在本研究中，筆者利用基因重組技術構建Bad?Caspase?8 靶向共表達融合基因，通過慢病毒轉染肝癌細胞，并隨機整合到宿主基因組中，使其持續表達Caspase?8 和Bad 蛋白。SK?HEP?1 肝癌細胞株是肝癌研究常用種子細胞，其貼壁生長，細胞活性好，容易轉染。本研究GV238 慢病毒載體轉染效率高達80.6%，甚至高于國外學者HORIBE 等［13］報道的同類型轉染效率。轉染72 h 后，實驗組Bad和Caspase?8 蛋白表達明顯增強，這表明融合基因整合至細胞基因組并成功轉錄翻譯相關蛋白，為后續實驗奠定基礎。其次，Bad 和Caspase?8 蛋白過表達顯著降低SK?HEP?1 肝癌細胞增殖活性，明顯增加細胞凋亡，這表明Bad 和Caspase?8 蛋白過表達對于SK?HEP?1 肝癌細胞生長活性起著負性調控作用。惡性腫瘤的轉移往往是腫瘤治療失敗的主要原因，也是晚期腫瘤患者預后不良的主要因素［14］。過去國內外學者致力于miRNA 技術調節wnt 信號通路抑制轉移發生，但是miRNA 隨著時間延長而降解失效，且容易出現干擾和誤差［15］。Bad和Caspase?8 基因作為其蛋白表達上游調控因素，直接作用于基因表達，增加下游促凋亡蛋白合成，顯著促進細胞死亡［16］。同時，細胞凋亡涉及到腫瘤轉移過程中的多個關鍵步驟，包括瘤細胞脫離原發瘤、逃避免疫細胞殺傷及在遠隔臟器定植等［17］。通過增加腫瘤細胞凋亡，可同時抑制其轉移行為，誘導癌細胞處于長期靜止和休眠狀態，有可能實現長期帶瘤生存［18-19］。本研究觀察Bad 和Caspase?8 蛋白過表達后，導致SK?HEP?1 肝癌細胞遷移數降低，提供一種抑制肝癌轉移的新思路。最后，對照組和空白組腫瘤生長迅速，而實驗組腫瘤體積注射后雖有所增加，但呈現腫瘤抑制生長狀態，從而有效驗證了本研究預想。本研究存在一定局限性，首先Bad 和Caspase?8 蛋白表達受多種基因和調控蛋白影響，可能出現基因和蛋白表達不一致情況；其次，不同的調控網絡可能在不同的細胞類型和器官中產生不同的生物學效應［20］，本研究只采用SK?HEP?1 肝癌細胞株作為研究對象，存在選擇偏倚，是否在人體內Bad 和Caspase?8 蛋白過表達也能很好發揮抗肝癌作用有待于進一步研究。

綜上，通過基因重組技術構建Bad?Caspase?8融合基因，可明顯增強促凋亡因子Bad 和Caspase?8 蛋白表達，顯著降低SK?HEP?1 肝癌細胞增殖活性，促進SK?HEP?1 肝癌細胞凋亡，減少SK?HEP?1肝癌細胞遷移，抑制SK?HEP?1 肝癌細胞體內成瘤效率，可作為肝癌靶向治療潛在靶點。