低氧誘導的HIF?1α對結腸癌細胞生長代謝的影響及其調控機制

何偉玲 李清海 嚴時佳 萬國輝

1中山大學附屬第一醫院胃腸外科（廣州510080）；2中山大學藥學院（廣州510006）

缺氧是實體腫瘤的一個典型特征。由于腫瘤細胞的增殖不受機體調節，當其增殖速度超過新生血管的生長速度時，則會在腫瘤內部距離血管大于180 μm（正常氧氣彌散距離）處形成一個缺血缺氧的微環境，同時由于腫瘤內部的新生血管通行性較差，更進一步促進了腫瘤內部缺氧微環境的形成［1］。缺氧誘導因子（hypoxia?inducible factor，HIF）家族是低氧環境下細胞代謝改變的主要啟動因子［2］，它由α亞基和β亞基組成，其中β亞基恒定表達，而α亞基作為主要調節亞基，自身受到氧濃度的調節［3］。絕大多數HIF 靶基因受到的是HIF?1α的調控，其誘導激活的信號通路參與并促進了一系列惡性腫瘤的進展。

研究指出，由HIF 轉錄激活因子誘導產生的異常血管生成、能量代謝異常如糖酵解和線粒體功能抑制等改變更加明顯，其中糖酵解產生的乳酸等酸性代謝產物聚集又可導致腫瘤微環境的pH 值下降，進一步激活更多與腫瘤代謝相關的酶［4］；此外，缺氧環境還誘導了許多腫瘤特異性的改變，如抑癌基因啟動子的甲基化修飾［2］、促進腫瘤細胞和浸潤性免疫細胞免疫抑制表型的形成和免疫逃逸［5-7］、促進腫瘤細胞上皮-間質轉化［8］、促進轉移前生態位的形成［9］、促進遠處轉移點腫瘤細胞的存活［10］等，在以上缺氧誘導性改變的共同作用下，腫瘤細胞可發生不同程度的增殖、侵襲、轉移和以放療為主的治療抵抗，使患者預后不良。但同時也有報道指出，HIF 有時也可對腫瘤起負調控作用，參與誘導腫瘤細胞凋亡［11］。

結腸癌（colorectal cancer）在傳統的化療聯合靶向治療方面取得了巨大的進展，但目前最大的挑戰仍是藥物的耐藥性問題［12］，其中低氧HIF 對不同藥物在腫瘤中產生獲得性耐藥起著至關重要的作用。隨著分子醫學的進步，陸續有學者提出靶向HIF 的腫瘤治療策略，但HIF 的異型性行為是這種策略實施的主要障礙［13-14］，因此更清晰了解HIF 的作用機制尤其是在腫瘤細胞負性調控機制尤為重要。本研究通過系統比較結腸細胞在常氧低氧中表達差異的基因，通過基因富集分析首次發現在低氧培養的結腸癌中與細胞生長代謝相關的巖藻糖基轉移酶Ⅳ（fucosyltransferase 4，FUT4）基因表達下調，預示了結腸癌腫瘤細胞代謝相關信號通路的異常和對潛在耐藥性的影響，并進一步探索了HIF?1α對其具體的負性調控機制及病理生理意義。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器基因表達芯片（GSE77606，基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）），HCT?116 和HT?29 細胞系（美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），杜爾貝科改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）（Corning，美國），10%FBS，支原體染色試劑盒（C0296，Beyotime，中國），GenePrint 10系統（B9510，Promega，美國），HIF?1α 特異性的短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，Quick ChangeⅡ定點突變試劑盒（200523，Agilent，美國），pCDH?puro 慢病毒載體（CD510B?1，System Biosciences），8mg/ml 溴化己二甲胺（TR?1003，Sig?ma），1 μg/mL 嘌呤霉素，Trizol 試劑（ThemoFisher，美國），PrimeScript RT 試劑盒（RR036A，Takara，日本），熒光染料SYBR?Green（RR820B，Takara，日本），雙熒光素酶載體pmiGLO（C838A，Promega，美國），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（RG028，Beyotime，中國），微小RNA（microRNA，miRNA）模擬物，miRNA 拮抗劑，各類引物和低氧培養箱。

1.2 方法

1.2.1 芯片數據分析從GEO 中篩選并下載符合研究條件的芯片（GSE77606），隨后使用R 語言（3.4 版本，http：//www.bioconductor.org）的edgeR 包對其進行基因差異表達分析?；虮磉_差異用log2 fold change（log2FC）計算，當log2FC ≥1、log2FC <-1 和P< 0.05 認為差異有統計學意義。利用在線工具KOBAS.3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）和DAVID 6.8（http：//david.ncifcrf.gov）對差異基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，探討差異表達基因的激活途徑，P<0.1認為差異有統計學意義。同時在TargetScan數據庫（http：//www.mirdb.org）篩選出與目的基因mRNA 的3'端非翻譯區（3'untranslated region，3'?UTR）互補的miRNA 以及在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Altas，TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中查找并分析原始結腸癌標本中目的基因的表達情況。

1.2.2 細胞培養HCT?116 和HT?29 細胞系來源于ATCC，并培養在37 ℃條件下、含10%FBS 和5%CO2的DMEM 中。并使用支原體染色試劑盒檢測有無支原體污染。同時使用GenePrint 10 系統的STR 分析對細胞系進行鑒定，具體操作參照制造商的說明書執行。缺氧條件下的細胞系培養在低氧培養箱中進行，箱內具體氣體含量參數為1%的O2，5%的CO2和94%的N2。

1.2.3 引物及shRNA 設計通過美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Infor?mation，NCBI）基因庫查找相應的基因序列，并按照引物及干擾RNA 設計基本原則，設計出目的基因、對應的miRNA 和HIF?1α 的引物序列及HIF?1α?sh RNA 序列。

1.2.4 定量反轉錄PCR（quantitative reverse tran?scription PCR，QRT?PCR）采用Trizol 試劑分離RNA，具體操作參照制造商的說明書執行，并使用PrimeScript RT 試劑盒合成相應的cDNA。采用熒光染料SYBR?Green 對擴增產物進行實時定量檢測。

1.2.5 熒光素酶報告實驗和突變實驗如前報道［15］，以HCT?116 細胞cDNA 為模板，用PCR 方法擴增目的基因mRNA 的3'?UTR 序列，將其克隆到雙熒光素酶載體pmiGLO 中，同時再利用美國安捷公司的Quick ChangeⅡ定點突變試劑盒對3'?UTR序列中的miRNA 結合位點進行定點突變，分別構建位點1、位點2 以及位點1 和2 共突變載體，同時用miRNA 模擬物、miRNA 拮抗劑和對照再次進行分組。用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性，表達效率用均一化后的螢火蟲熒光素酶信號和海腎素熒光素酶信號來反應。

1.2.6 基因表達載體的構建和感染靶基因的穩定敲減由慢病毒介導的HIF?1α?shRNA 來執行，而靶基因的沉默和過表達則由pCDH?puro 慢病毒載體實現。在相應病毒載體構建完成后，將符合要求的病毒載體在8 mg/mL 溴化己二甲胺的介導下感染靶細胞。最后用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選出對應的獲得穩定敲減、敲除、沉默或過表達的細胞。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0 對實驗數據進行分析，兩獨立樣本采用t檢驗，多組定量數據采用方差分析，當P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 數據分析結果及驗證GEO 芯片數據（GSE?77606）及KEGG 通路富集分析顯示低氧環境下結腸癌細胞的代謝通路異常（P= 0.036），FUT4 表達下調（圖1A、B）。QRT?PCR 證實FUT4 在低氧培養的結腸癌細胞系HCT?116 和HT?29 中低表達，其在HCT?116 中表達明顯降低（P< 0.001）（圖1D），而TCGA 數據庫資料顯示原始結腸癌標本中FUT4 基因表達升高（P<0.05）（圖1C）。

圖1 數據分析及驗證結果Fig.1 Bioinformatics analysis of colon cancer cells under hypoxia and validation of FUT4 expression

2.2 miRNA 篩選結果在TargetScan 等數據庫中篩選到與FUT4基因mRNA3'?UTR 互補的miRNA為hsa?miRNA?23a?3p，且該miRNA 與FUT4mRNA存在兩個靶向作用位點，分別為位點1（第781?788位堿基）和位點2（第867?873 位堿基）。見圖2。

2.3 相關基因引物及干擾RNA 序列設計通過美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NICB）基因庫查找到相應基因序列。根據引物及干擾RNA 序列設計基本原則，確定了相關基因引物序列及HIF?1α?shRNA干擾序列。見表1。

圖2 FUT4（mRNA）?hsa?miRNA?23a?3p 匹配結果Fig.2 Complementary matching analysis of hsa?miRNA?23a?3p in the 3'UTR of FUT4

表1 引物序列及干擾RNA 序列Tab.1 Real?time PCR primer sequences and shRNA sequence

2.4 熒光素酶報告實驗和突變實驗結果及hsa?miRNA?23a?3p表達驗證熒光素酶報告實驗和突變實驗顯示熒光強度除了與hsa?miRNA?23a?3p的濃度有關外，還與作用位點有關，證實hsa?miRNA?23a?3p 可通過靶向位點1 和位點2，促進FUT4mRNA 的降解，其中位點1 在FUT4?hsa?miRNA?23a?3p 的相互作用中起主要介導作用（圖3A）。同時證實了低氧環境可誘導hsa?miRNA?23a?3p的表達（圖3B）

2.5 HIF?1αsh RNA干擾實驗結果HIF?1αsh RNA干擾實驗顯示，正常氧環境下，HCT?116 細胞中HIF?1α的表達與hsa?miRNA?23a?3p的表達無明顯相關性，但在低氧環境下，與無義干擾相比，用特異性的shRNA 對HIF?1α進行干擾后，hsa?miRNA?23a?3p的表達明顯下調（圖5，P< 0.05）。上述實驗說明HIF?1α可作為轉錄激活因子調控miRNA?23a?3p 的表達。

2.6 FUT4?hsa?miRNA?23a?3p相關性驗證hsa?miRNA?23a?3p過表達和沉默實驗顯示，當在HCT?116細胞系中導入反義表達miR?23a的質粒miRZip?23a時，FUT4基因的表達明顯升高，相反，當細胞內導入的質粒為miR?23a?3p過表達載體時，FUT4基因的表達明顯下調，即hsa?miRNA?23a?3p 可調控FUT4mRNA 的表達水平（圖5，P<0.05）。

圖3 熒光素酶報告實驗和突變實驗結果及hsa?miRNA?23a?3p 表達驗證Fig.3 Results of luciferase activity assay and measurement of hsa?miRNA?23a?3p expression

圖4 HIF?1αshRNA 干擾實驗結果Fig.4 Results of HIF?1α knockdown assay

圖5 QRT?PCR 檢測不同誘導條件下FUT4 的表達情況Fig.5 Measurement of FUT4 expression under hypoxia by QRT?PCR

3 討論

結腸癌作為胃腸道中最常見的惡性腫瘤之一，近20年來，其發病率呈明顯上升趨勢，目前結腸癌的發病率和病死率分別排在胃腸道腫瘤的第一位和第二位［16］。同時結腸癌作為一類實體腫瘤，在其快速增長的過程中往往也會因為新生血管生長滯后和通行性差而導致腫瘤細胞缺氧狀態的形成，因此對結腸癌在低氧狀態下的病理生理機制探索具有重要的預防和治療意義。本研究發現，低氧環境下結腸癌細胞可通過HIF?1α/hsa?miRNA?23a?3p/FUT4軸下調FUT4的表達。

如前所述，HIF?1α作為缺氧反應相關基因表達的轉錄激活因子和調節因子，它可以與位于靶基因5'或3'區的缺氧反應原件的增強子結構域結合促進其轉錄和表達，主要促進腫瘤惡性進展，但有時也可促進腫瘤細胞凋亡。其中缺氧反應元件主要包括血紅素氧合酶-1、血管內皮生長因子、糖酵解酶、葡萄糖轉運蛋白1/4 和一些腫瘤特異性表達基因或非編碼RNA［17］。miRNA 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼RNA，雖不直接翻譯蛋白參與細胞的生命代謝活動，但可在動植物中參與轉錄后基因表達調控，每個miR?NA 可以有多個靶基因，而不同的miRNA 也可靶向同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA 來調控多個基因的表達，也可通過幾個miRNA 的組合來精細調控某個基因的表達。研究顯示，miRNAs 在惡性腫瘤的發展過程中既可作為腫瘤促進因子又可作為腫瘤抑制因子。但針對miRNA?23a?3p 在結直腸癌中的研究少有報道。

FUT4屬于巖藻糖基轉移酶（fucosyltransferase，FUT）家族，是一類具有重要生化作用的糖基轉移酶。該家族目前共13 個成員，主要負責催化從核苷二磷酸巖藻糖中將巖藻糖基轉移到受體分子上，其中受體分子主要為糖蛋白或糖脂分子上的寡糖鏈［18］，但有時也可直接將巖藻糖基轉移到多肽鏈上［19］。存在于細胞表面且被巖藻糖基化的寡糖包括Lewis A（Le（a））、Lewis B（Le（b））、Lewis X（Le（x））（CD15 抗原）、Lewis Y（Le（y））等路易斯寡糖和sialylLewis A（sLe（a））、sialylLewis X（sLe（x））等被唾液酸化的路易斯寡糖，其中FUT4主要負責合成Le（x）/CD15 和Le（y）。這些寡糖鏈是細胞表面糖蛋白和糖脂發揮其生理功能的重要組成部分之一，可參與細胞識別與黏附、胚胎著床與發育、白細胞遷移等炎癥反應以及腫瘤細胞的遷移進展和免疫逃逸等生理過程［20］。

目前的研究顯示，FUT4及其修飾的巖藻糖基化糖蛋白抗原（以Le（x）/CD15 為主）的過表達與包括結腸癌在內的多種腫瘤的發展、轉移和化療抵抗有關［21］，這與本研究從TCGA 數據庫中獲得的分析結果一致（圖1C）。GIORDANO 等［22］的研究表明，約43%的轉移性結直腸癌患者標本中CD15/FUT4呈高表達狀態，且與低表達者相比，CD15/FUT4高表達的患者腫瘤內部CD3+和CD8+T 細胞比例下降，且對西妥昔單抗和貝伐珠單抗等靶向藥物的原發耐藥率明顯更高，預后也更差，這意味著FUT4可以促進腫瘤的轉移、耐藥和免疫逃逸。另一項研究指出［23］，在正常氧濃度培養的SW620和SW480細胞系中加入可靶向FUT4mRNA的miR?26a/26b 模擬物可抑制腫瘤細胞的侵襲性生長。而在其他腫瘤的相關研究中同樣證實，FUT4可參與乳腺癌細胞的上皮-間質轉化以促進細胞侵襲性生長［24］，miR?493?5p 則可通過靶向FUT4mRNA降低乳腺癌細胞的侵襲性和致瘤性［25］。而miR?NA?125a?5p 可以通過靶向FUT4mRNA 進而抑制膀胱癌的進展［26］。

但在本研究中，結腸癌細胞可以通過HIF?1α/hsa?miRNA?23a?3p/FUT4軸下調FUT4的表達，這可以理解為是HIF 對腫瘤的又一個負調控機制。HIF 和FUT4目前被公認為是惡性腫瘤侵襲性進展和轉移主要的促進因素。但有趣的是，本研究證實了這兩大因素之間存在負調控關系。雖然在原始結腸癌標本中，FUT4的表達是上調的，但可以肯定的是，這種表達差異并不是由HIF 所誘導的，或許還有其他拮抗HIF 誘導FUT4表達下調的機制值得進一步探索。